檳榔內生真菌的分離與初步鑒定

宋薇薇,牛曉慶,余鳳玉,朱 輝,唐慶華,覃偉權

(中國熱帶農業科學院 椰子研究所,海南 文昌 571339)

檳榔內生真菌的分離與初步鑒定

宋薇薇,牛曉慶,余鳳玉,朱 輝,唐慶華,覃偉權*

(中國熱帶農業科學院 椰子研究所,海南 文昌 571339)

為了解檳榔內生真菌的多樣性,采用組織塊培養法從檳榔根、葉、花中分離純化得到47株內生真菌,同時對這些菌株進行了rDNA-ITS序列擴增和系統發育分析。結果表明:所得內生真菌分屬于8個屬,包括青霉屬(Penicillium)、鐮孢屬(Fusarium)、葉點霉屬(Phyllosticta)、彎孢霉屬(Curvularia)、黑孢屬(Nigrospora)、炭疽菌屬(Colletotrichum)、枝頂孢屬(Acremonium)和突臍蠕孢屬(Exserohilum)。其中,青霉屬(Penicillium)和鐮孢屬(Fusarium)為優勢菌屬,這2個屬的內生菌株數分別占分離菌株總數的31.91%和27.66%。

檳榔;內生真菌;分離；鑒定; rDNA-ITS序列;系統發育分析

檳榔(ArecacatechuL.)為棕櫚科(Palmaceae)檳榔屬(Areca)常綠喬木,原產于東南亞,主產于印度、巴基斯坦、馬來西亞、印度尼西亞、泰國和中國等國家。在我國,檳榔產區主要集中在海南省,產量約占總產量的95%以上(未計中國臺灣省)。除作為熱帶園林綠化樹種外,檳榔還具有重要的藥用價值,位居中國四大南藥(檳榔、砂仁、益智、巴戟)之首,其果實、種子、皮、花均可入藥。目前,檳榔產業已成為海南省僅次于橡膠的第二大支柱產業,是農業產業結構調整中主要的栽培作物之一,發展前景十分廣闊[1-2]。經國家批準,檳榔在海南省被列入生態經濟林樹種,主要分布于海南省東部、中部和南部山區。

植物內生菌是一類生活于植物組織、器官內部的微生物,其生活史的一定階段或全部階段在健康植物的各種組織、器官的活細胞內或細胞間隙完成,屬于植物組織內的正常菌群。被內生菌感染的宿主植物不表現出外在病癥,可通過組織學方法從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生[3]。內生菌長期生活在植物體內的特殊環境中,并與寄主協同進化,在演化過程中形成了互利共生關系。研究表明,感染內生菌的植物宿主往往具有生長快速、抗逆境、抗病害、抗動物危害等優勢,比未感染植株更具有生存競爭力[4]?，F已在多種灌木、草本植物、栽培作物、果樹、苔蘚和蕨類植物中發現并分離了大量內生菌。目前,關于檳榔的研究主要集中在其自身化學有效成分等方面,而有關檳榔內生菌分離鑒定的研究報道很少。Liu A R等[5]在研究海南內生擬盤多毛孢屬真菌時,從檳榔樹中分離到1株Pestalotiopsisphotiniae(石楠擬盤多毛孢)。謝穎等[6]在篩選香蕉枯萎病拮抗內生菌時,從檳榔組織中分離到8株內生菌,其中真菌6株、細菌2株,但未做菌株鑒定。為了發掘更多的內生菌資源,我們對檳榔的內生真菌進行了分離鑒定,初步探討了其多樣性,以期為檳榔內生菌在植物病害防治中的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檳榔材料 自萬寧市三更羅鎮檳榔園采集健康、無病蟲的檳榔根、葉、花組織,用于內生真菌的分離。

1.1.2 主要試劑和儀器 真菌基因組DNA提取試劑盒、PCR MasterMix購自北京索萊寶科技有限公司(Solarbio);其它試劑均為國產或進口分析純試劑。PCR儀為Takara PCR Cycler Dice TP650;核酸電泳儀為北京六一儀器制造廠產品;離心機為Eppendorf公司生產的Sentrifage5810;凝膠成像系統為美國Gene公司的產品。

1.1.3 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar, PDA)培養基:馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL, pH自然；于121 ℃下滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌的分離和純化 取健康檳榔的根、葉、花樣品，用自來水沖洗干凈,晾干備用。采用組織塊分離法,分離時將各組織剪成2 cm左右的小段,然后按常規無菌操作進行表面消毒:用75%酒精浸泡1～2 min,用0.1%升汞消毒3～5 min,用無菌水沖洗4～5次,用滅菌濾紙吸干多余水分,最后用無菌解剖刀將材料切成約0.5 cm× 0.5 cm的小塊。將上述組織塊置于PDA平板培養基上,在25 ℃下恒溫培養。將最后一次沖洗組織塊后的無菌水作為對照,以驗證消毒效果[7-8]。

待組織塊邊緣長出菌絲后,挑取邊緣菌絲轉接到新鮮的PDA培養基上,待菌落長成后,再挑取邊緣菌絲進行轉接；如此反復純化4～5次后,轉接到PDA斜面上,在4 ℃下保藏備用。

1.2.2 內生真菌DNA的提取和rDNA-ITS序列的擴增 采用真菌基因組DNA提取試劑盒,提取菌株的總DNA。以提取的總DNA為模板,采用真菌rDNA-ITS區通用引物進行PCR擴增。引物序列為ITS1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和ITS2(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。PCR反應體系(50 μL):2×MasterMix 25 μL、ITS1(10 μmol/L) 2.5 μL、ITS2(10 μmol/L) 2.5 μL、DNA模板2.5 μL,用ddH2O補足至50 μL。PCR擴增條件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35個循環;72 ℃ 10 min,10 ℃ 5 min。

1.2.3 內生真菌rDNA-ITS序列測定及系統發育分析 PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,將檢測到目的條帶的樣品送往上海生物工程技術服務公司進行測序。

將所得各菌株的rDNA-ITS序列在GenBank核酸序列數據庫中進行BLAST比對分析,尋找相似性較高的序列,進行菌株鑒定。進一步選取分離所得的不同屬的內生真菌,下載其在GenBank中最相近的同源序列。將菌株的rDNA-ITS序列用ClustalX 2.1軟件進行多序列比對并匹配排序；應用MEGA 5.1軟件,采用鄰接法(Neighbour-Joining method),以1000為重復值進行Bootstrap檢驗,構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 檳榔內生真菌的分離結果

通過分離純化,從健康檳榔組織中共獲得內生真菌47株,其中,來源于根、葉、花的內生真菌菌株分別為10、31、6株,見圖1。對照平板經25 ℃培養5～7 d后,培養基上無明顯菌落長出,表明試驗材料表面已消毒徹底。

2.2 菌株rDNA-ITS序列的擴增與測序

對分離出的檳榔內生真菌進行DNA提取及rDNA-ITS序列PCR擴增,1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示,擴增序列條帶在600 bp左右,見圖2。PCR產物經凝膠電泳檢測后,直接送往上海生工測序。47株檳榔內生真菌均獲得了測序結果。

2.3 檳榔內生真菌的鑒定

經過測序,將所獲得的47株檳榔內生真菌rDNA-ITS片段和GenBank中的已知序列進行BLAST比對,查找與其同源性較高的菌株,最終確定檳榔內生真菌屬于8個屬,分別為青霉屬(Penicillium)、鐮孢屬(Fusarium)、葉點霉屬(Phyllosticta)、彎孢霉屬(Curvularia)、黑孢屬(Nigrospora)、炭疽菌屬(Colletotrichum)、枝頂孢屬(Acremonium)和突臍蠕孢屬(Exserohilum),表明檳榔內生真菌具有一定的生物多樣性。結果見表1。

由表1可見:在所分離的47株檳榔內生真菌中,青霉屬(Penicillium)和鐮孢屬(Fusarium)為優勢菌屬,分別占分離菌株總數的31.91%和27.66%;其次是葉點霉屬(Phyllosticta),占總株數的21.28%;而枝頂孢屬(Acremonium)和突臍蠕孢屬(Exserohilum)各只有1株,均只占總株數的2.13%。

2.4 檳榔部分內生真菌系統發育樹的構建

選取BLJ-1、BLJ-16、BLJ-29、BLJ-39、BLJ-42、BLJ-44、BLJ-46、BLJ-47共8株來源于不同屬內生真菌的rDNA-ITS序列及在GenBank中與其同源性最高的序列(表2),采用Neighbor-Joining方法構建系統發育樹,結果見圖3。

如圖3所示,選取的菌株均與其在GenBank中的同源菌株同處系統發育樹的一個分支,遺傳距離很近,表明這8株內生真菌可以歸類到Fusarium、Acremonium、Colletotrichum、Nigrospora、Curvularia、Exserohilum、Penicillium和Phyllosticta。此外,FusariumBLJ-16和AcremoniumBLJ-46，CurvulariaBLJ-39和ExserohilumBLJ-47，PenicilliumBLJ-1和PhyllostictaBLJ-29這3對不同屬的真菌序列間分別顯示了較高的一致性,可能來源于遺傳距離較近的類群。

表1 檳榔內生真菌的鑒定結果

注:分離比例指分離純化的菌株占全部分離菌株的百分比。

圖1 部分檳榔內生真菌在PDA培養基上的菌落形態

菌株編號片段長度/bp同源菌株序列號一致性/%BLJ-1581Penicilliumsp.FJ008995.199BLJ-16569FusariumoxysporumKJ562373.199BLJ-29649PhyllostictaaloeicolaKR183768.198BLJ-39598Curvulariasp.JQ783059.199BLJ-42561NigrosporasphaericaKM921666.199BLJ-44586ColletotrichumgloeosporioidesKT390195.1100BLJ-46581AcremoniumsclerotigenumKT878352.199BLJ-47613Exserohilumsp.JN207305.199

3 結論與討論

近年來,植物內生菌由于能夠產生豐富多樣的具有農藥活性的次生代謝產物,在自然界中具有重要的生態學作用,不僅可以為植物提供所需要的營養物質,還參與植物的防衛功能,可以增強植物的抗逆境、抗病害能力,因此已經成為當前研究的一大熱點。

內生菌普遍存在于各種水生和陸生植物中,表現出豐富的群落多樣性。通常,從1種植物中可分離到的內生菌為數種至數十種,有的甚至多達數百種。Melnick等[9]從可可的葉、果莢、枝和花中分離獲得69株內生細菌,劃分為5屬15個種群。鄭艷等[10]分離得到內生菌129株,其中內生真菌4屬、6種、58株,優勢屬為鐮刀菌屬(Fusarium);內生細菌3屬、9種、71株,芽孢桿菌屬Bacillus為優勢屬。有關研究發現,內生菌在植物根、莖、葉、花、果實、種子等組織和器官內均有分布,其分布情況取決于宿主植物本身以及內生菌的種類,在宿主植物不同器官的分布存在差異[4,11]。為了揭示檳榔內生真菌的多樣性,本研究通過分離和鑒定,從檳榔根、葉和花中共得到47株檳榔內生真菌,其中大部分菌株來源于葉部,共31株,而從根、花中分別只獲得10株和6株；初步將分離的檳榔內生真菌菌株歸類到8個屬,即青霉屬(Penicillium)、鐮孢屬(Fusarium)、葉點霉屬(Phyllosticta)、彎孢霉屬(Curvularia)、黑孢屬(Nigrospora)、炭疽菌屬(Colletotrichum)、枝頂孢屬(Acremonium)和突臍蠕孢屬(Exserohilum)。其中,青霉屬(Penicillium)和鐮孢屬(Fusarium)為優勢內生真菌屬。以上結果表明,檳榔中內生真菌存在著較為豐富的生物多樣性,它們可能是檳榔內生菌的重要組成部分。本研究結果不但豐富了檳榔內生菌資源,也為今后檳榔內生菌的進一步開發利用提供了理論參考。

M: DL2000 Marker; 1～10:部分內生真菌rDNA-ITS序列擴增條帶。

圖2 檳榔部分內生真菌rDNA-ITS序列的PCR產物電泳圖譜

圖3 基于rDNA-ITS序列構建的部分檳榔內生真菌的系統發育樹

由于內生菌在植物體內普遍存在,其種類和數量常受到地域、品種、采樣時期、采樣部位、培養基等因素的影響，因此本研究只采集了檳榔的根、葉和花進行內生真菌的分離,采集樣本數量和采樣地點均有限,分離的內生真菌種類可能會受到一定的限制,這也可能是本研究未分離到擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)真菌[5]的原因之一。此外,有些內生菌不能在人工培養基上生長或對培養基具有選擇特異性；本實驗以PDA培養基為分離純化培養基,可能造成某些內生菌株未被分離出來[6,12]?？偟膩碚f,本研究結果在一定程度上反映了檳榔內生菌的多樣性。今后有必要增加采樣點、采樣部位、培養基種類等來獲得更多的內生菌資源；而關于檳榔優勢內生菌的功能等方面也有待于今后進一步研究。

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(責任編輯:黃榮華)

Isolation and Preliminary Identification of Endophytic Fungi from Arecanut (Arecacatechu)

SONG Wei-wei, NIU Xiao-qing, YU Feng-yu, ZHU Hui, TANG Qing-hua, QIN Wei-quan*

(Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wenchang 571339, China)

In order to understand the diversity of endophytic fungi in arecanut (ArecacatechuL.), we used tissue block culture method to isolate and identify 47 endophytic fungal strains from the root, leaf and flower of arecanut, amplified the rDNA-ITS sequence of these strains, and constructed their phylogenetic tree. The results showed that the obtained 47 endophytic fungal strains belonged to 8 genera, includingPenicillium,Fusarium,Phyllosticta,Curvularia,Nigrospora,Colletotrichum,AcremoniumandExserohilum. Among these genera,PenicilliumandFusariumwere the dominant genera, and the endophytic fungal strains in these 2 genera accounted for 31.91% and 27.66% of total isolated strains, respectively.

Arecanut; Endophytic fungi; Isolation; Identification; rDNA-ITS sequence; Phylogenetic analysis

2017-02-22

海南省自然科學基金項目“內生菌對檳榔黃化病發生危害的影響”(314144);海南省重點研發計劃項目“檳榔拮抗內生菌 資源的篩選與利用”(ZDYF2016058)。

宋薇薇(1981─),女,助理研究員,博士,從事熱帶經濟作物病害生物防治研究。*通訊作者:覃偉權。

S792.91

A

1001-8581(2017)06-0066-04