醬油制曲研究進展

謝承佳，莊琪

(揚州工業職業技術學院，江蘇 揚州 225000)

醬油制曲研究進展

謝承佳，莊琪

(揚州工業職業技術學院，江蘇 揚州 225000)

制曲是醬油生產中的關鍵步驟，對成品醬油的質量有重要影響。文章論述了醬油制曲的研究進展，包括制曲原料、菌種和工藝等，以期為實際工作提供參考。

醬油；添加劑；多菌種制曲；米曲霉

醬油是我國傳統的釀造型調味品，因其味道鮮美、營養豐富廣受大眾喜愛。醬油釀造有一諺語：一曲、二醪、三熬油，說明制曲是醬油生產的關鍵步驟。所謂制曲，指的是菌種在適宜的條件下在曲料上擴大培養的過程，分為種曲制備和成曲制備。前者的目的是獲得大量健康的孢子，后者是為了產生包括蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、脂肪酶等在內的豐富酶系，有利于在后續發酵過程中更加充分地進行生物轉化。制曲是生產醬油的基礎，對成品醬油的質量有重要影響。文章對醬油的制曲原料、菌種、工藝等進行了論述，以期為實際工作提供參考。

1 制曲原料

制曲的原料主要包括蛋白質原料、淀粉質原料和水。蛋白質原料的作用是提供微生物生長的氮源，常用的有大豆和豆粕。豆粕是大豆榨油的副產物，又分為低溫豆粕和高溫豆粕，后者由于價格便宜是最常用的醬油釀造原料[1]。淀粉質原料主要有面粉和麩皮，既提供碳源，又作為疏松劑，防止蒸料時夾心、制曲時通風不暢。近年來，一方面，由于豆類等蛋白質原料價格上漲，有必要尋找新的替代原料；另一方面，本著資源化利用各類廢渣的原則，豆腐渣、大米渣、玉米蛋白粉、花生粕、菜籽粕、動物內臟、醋渣、醬油渣等各種副產物或下腳料也用于醬油的制曲及后續發酵過程[2-7]。

這些替代品大部分本身營養成分較為豐富，含有豐富的蛋白質、脂肪及多種微量元素，見表1。為了使原料中的有效成分能夠充分釋放并被利用，需用纖維素酶處理破壞細胞壁以利于發酵的進行[8]，或在高溫下蒸煮以達到一定的消化率。以動物內臟作為制曲原料時，由于其本身蛋白質含量略低且動物組織中較高的蛋白酶活性，減弱了環境對米曲霉蛋白酶的誘導作用，成曲的蛋白酶活性水平可能較低。

表1 制曲原料成分分析 %

注：“*”代表此項指標在原文中未進行測定。

2 曲料添加劑

2.1 營養物

制曲原料中的碳源與氮源多為高分子結構，需酶解為單體后才能被微生物利用。因此，如果在原料中添加一些霉菌能夠直接利用的營養物，對孢子的產生和菌絲的生長都很有利。倪海晴等[13]比較了不同的添加劑對成曲酶活和醬油質量的影響，在單因素實驗中，葡萄糖作為外加碳源、NaNO3作為外加氮源對酶活的提高最顯著，添加0.25%葡萄糖、0.1% NaNO3、0.05% ZnSO4時，成曲的蛋白酶活力和糖化酶活力比對照組分別提高了36.75%和46.02%；富含各種氨基酸、維生素及礦物質的酵母抽提物對種曲的培養也有顯著的促進作用， 1.30%的添加量可使種曲孢子數提高54.88%，且更健壯[14]；梁姚順發現酵母提取物對成曲酶活也有促進作用[15]。

2.2 無機鹽及金屬離子

無機鹽本身為微生物生長過程所必需的。此外，醬油制曲過程中，一方面微生物需要產生酶分解消化營養物，進行自身生長；一方面酶活高低也是成曲的質量指標之一，而很多酶的活性中心都需要金屬離子激活，因此在制曲過程中額外添加無機鹽及金屬離子對曲料質量有一定的促進作用。我國和日本很早就有文獻報道錳離子和草木灰能夠提高種曲質量。草木灰除了是很多酶的激活劑之外，還兼具調節細胞透性、提供營養等多種功能。魯梅芳等[16]的研究表明：適量添加MnSO4、CaC12、KH2PO4能提高孢子出芽率，建議添加量分別為0.04%，0.4%，0.2%；武金霞等[17]在培養基中添加NH4NO3以提高種曲孢子數；此外，ZnSO4對成曲蛋白酶和糖化酶活力有促進作用，這可能與Zn2+對金屬蛋白酶的激活作用以及參與DNA和RNA聚合酶的活動有關，SO42-本身對孢子生長也有促進作用[18]。

2.3 抑菌劑和防腐劑

制曲過程條件粗放，開放的狀態會增加不良微生物的感染量，影響制曲效果。制曲過程中常見的雜菌包括細菌、酵母和霉菌，其中以細菌污染為最多。可在種曲制作時加入曲料量 0.3%的冰醋酸或0.5%～1.0%的醋酸鈉形成酸性環境，抑制雜菌污染，促進孢子發芽[19,20]。顧立眾等[21]將馬齒莧、茵陳提取物和丙酸鈉制成的復合制劑加入曲料中，在添加量很少的情況下就可以使細菌污染率降低92%，這主要與丙酸鈉的抗菌作用有關。但實際應用時，要綜合考慮丙酸鈉對發酵菌種的影響。林彥彬的研究指出：抑菌劑對米曲霉的抑制作用可通過無機鹽及金屬離子的激活作用補償，添加丙酸鈣的情況下，添加0.05% MgSO4和0.025% ZnSO4有助于孢子萌發。

天然植物提取物也具有抑菌作用。見姬等[22]比較了24種植物提取液對2種耐鹽酵母的影響，發現香葉、桂皮、小茴香、肉桂均具有較好的抑制作用，可用于醬油或蜜餞生產中防止腐敗或表面產生白醭。此外，為了防止制曲過程中的青霉污染，也可將生物拮抗酵母拌入種曲制成曲，防止雜菌污染的同時還可提高醬油的質量[23]。

2.4 蛋白酶誘導劑

蛋白酶活力是成曲的重要質量指標，不少科研人員致力于此方面研究。宋小焱等[24]發現在不改變南方醬油制曲原料主要配方的情況下，單獨添加1.5%芝麻餅或2%花生餅粉能使成曲蛋白酶活力分別提高51%或40%，原因可能在于米曲霉蛋白酶需外界誘導產生，但原料中的大豆源蛋白質對后續酶活提升作用較小，具體機理仍需進一步研究；武金霞等用米曲霉的激活性營養因子制成了激活劑，可提高種曲孢子發芽率及成曲酶活，提高原料利用率[25,26]。

3 制曲菌種和工藝

3.1 米曲霉制曲

我國醬油制曲中所用的微生物主要是米曲霉，制曲菌種的基本要求是不產真菌毒素；能產生活力較高的蛋白酶和淀粉酶；生長快、抗雜菌能力強；不產生異味等。米曲霉滬釀3.042是國內醬油廠家廣泛使用的發酵菌種，具有生產周期短、抗性好、管理粗放等優點。為了獲得更高的產量，不少學者對滬釀3.042的最佳產酶條件進行了研究。

李秀婷等[27]考察了滬釀3.042酶系的主要影響因素，研究發現：菌株固體發酵的最佳碳源為麩皮，氮源為蛋白胨，初始pH 6.0～8.0，溫度30 ℃時，中性蛋白酶的產量最大。闞清華等[28]利用響應面分析法研究了滬釀3.042的產酶條件，最適條件為22 ℃培養，初始pH 7.0，料水比1∶0.8。

滬釀3.042的主要缺點在于酶系不全面，糖化酶和酸性蛋白酶低。不少研究者致力于尋找新的生產菌或改良滬釀3.042，旨在篩選出蛋白酶活力更高或更能適應高鹽稀態醬油釀造中高鹽分、低pH環境的菌株[29,30]。傅力等[31]通過紫外和LiCl復合誘變獲得1株蛋白酶高產菌株，與出發菌相比，蛋白酶活力提高了33.3%且遺傳穩定性良好。

3.2 混合菌種制曲

混合菌種制曲是指以米曲霉為主，添加其他菌種協同發酵制曲。混合菌種制曲的主要目的是提高原料利用率和醬油成品香氣、色澤等質量標準[32]。與米曲霉混合發酵的菌株多具有如下特征：糖化酶和酸性蛋白酶活力較高，能與米曲霉酶系互補；能產大量纖維素酶，破壞原料的細胞壁，釋放出其中的蛋白質與淀粉等原料；產酯化酶，豐富產品的香氣；產紅色素，增加醬油色澤。常用的混合制曲菌種包括：產生大量淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、谷氨酰胺酶的黑曲霉；產纖維素酶、酯化酶的根霉和木霉；產糖化酶、酯化酶和紅色素的紅曲霉；產纖維素酶的粗壯脈紋胞菌等。混合制曲常用菌種及配比見表2。

表2 混合制曲菌種及配比

黑曲霉是較為常用的混合制曲菌種。楊欽階等采用米曲霉和黑曲霉混合制大曲，鹽水原料比為2∶1，45 ℃發酵120天后原料蛋白質利用率為86.28%，氨基酸轉化率為55.64%，成品醬油感官評價好；程世杰等對米曲霉和黑曲霉混合制曲發酵中的氨基酸態氮與總氮進行了測定，發酵30天后全氮利用率和氨基酸態氮可達82.21%和1.162 g/dL，與單菌種相比分別提高了35%和7.8%；王亞威等采用雙菌制曲，醬油的氨基酸態氮生成率提高了13.46%；米曲霉與黑曲霉、根霉、木霉、粗壯脈紋胞菌等復配多菌種制曲也均取得了較好的效果。

糖化增香曲是由煙灰紅曲霉(Monascusruber)和紫紅曲霉(Monascuspurpureus)菌株構成的復合曲種，具有較強的糖化力、酯化力和增色能力，在發酵過程中能形成多種酸、酯、醇、天然色素及生物活性物質，起到發酵增香的作用[43]。徐歡歡等[44]在高鹽稀態醬油釀造中添加糖化增香曲與米曲霉混合制曲，氨基酸態氮含量、氨基酸生成率、全氮含量及還原糖含量分別提高了14%，9%，12%和5%；黃文彪等[45]添加糖化增香曲制曲，發酵90天后，高鹽稀態醬油的還原糖和可溶性無鹽固形物含量分別提高了47%和7%，但是糖化增香曲會影響中性和酸性蛋白酶活力；陳之瑤等[46]的研究也指出糖化增香曲對大曲蛋白酶的影響，如果以中性蛋白酶活力為指標，建議添加0.4‰的米曲霉和1.0‰的糖化增香曲，如果以酸性蛋白酶活力為指標，由于糖化增香曲對其有抑制，僅建議添加0.4‰的米曲霉。

混合菌種制曲中，由于多種菌種之間存在拮抗作用，需嚴格控制接種量和菌株配比。有研究發現采用雙菌制曲時，米曲霉含量高于95%時會強烈抑制黑曲霉；戴德慧等[47]研究發現接種量對糖化酶和蛋白酶活力有很大影響。因此，為了獲得更好的協同作用、減少競爭性抑制對各種酶活力的影響，多采用分開制種曲、混合制大曲或者分開制曲、混合發酵的工藝。也有研究采用激活性營養因子解決混菌發酵中多菌株生長不同步的問題。武金霞等用米曲霉的激活性營養因子制成了激活劑，可激發并加速米曲霉的萌發，在雙菌種混合制曲時，使米曲霉和黑曲霉的孢子萌發率更為一致[48]。

混合菌種制曲的工藝參數要綜合考慮多個菌種的最適產酶溫度及協同作用，研究報道制曲溫度多為30～36 ℃，制曲時間約為30～48 h，這與米曲霉所產中性蛋白酶和堿性蛋白酶的最適溫度為32 ℃、米曲霉大部分酶的最高酶活出現在36～39 h的研究結果較為一致。

4 結論

目前，我國醬油生產主要采用高鹽稀態和低鹽固態發酵，但在制曲這一步上，工藝基本一致。除了本文中涉及的制曲原料、添加劑及制曲工藝外，制曲過程的具體條件控制，如品溫、通風量、松曲時間、曲料厚度等均對成曲質量有重要影響[49,50]，在實際操作過程中需嚴格控制以獲得高質量的產品。

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Research Progress of Koji Making for Fermented Soy Sauce

XIE Cheng-jia, ZHUANG Qi

(Yangzhou Polytechnic Institute, Yangzhou 225000, China)

Koji making is a key step in soy sauce production, which has an important influence on the quality of finished soy sauce. In this paper, the research progress of koji making is discussed, including the koji-making raw materials, strains and process, in order to provide references for the practical work.

soy sauce;additive;multi-strain koji making;Aspergillusoryzae

2017-01-19

謝承佳(1982-)，女，江蘇南京人，講師，碩士，主要從事生物化工教學方面的研究。

TS264.21

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.016

1000-9973(2017)06-0077-04