響應面法優化花椒精油酵母微膠囊制備工藝

劉鑫，陳虹宇，李增威，曾月，陳姝娟,陳莎莎

(1.黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，哈爾濱 150088；2.四川農業大學 食品學院，四川 雅安 625014；3.黑龍江省華測檢測技術有限公司，哈爾濱 150025)

響應面法優化花椒精油酵母微膠囊制備工藝

劉鑫1，陳虹宇2，李增威2，曾月2，陳姝娟2,陳莎莎3

(1.黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，哈爾濱 150088；2.四川農業大學 食品學院，四川 雅安 625014；3.黑龍江省華測檢測技術有限公司，哈爾濱 150025)

以生香釀酒活性干酵母為壁材包埋花椒精油，運用Box-Behnken中心組合設計和響應面分析法,分別研究包埋溫度、包埋時間、芯材比對花椒精油酵母微膠囊包埋率的影響。試驗結果表明：在包埋溫度為64 ℃，包埋時間為8 h，芯材比為1∶1，花椒精油的包埋率平均值為68.71%，與理論預測值69.39%基本相符。經緩釋試驗可知，微膠囊能降低花椒精油香味釋放速度，且具有較好的穩定性。

釀酒活性干酵母；花椒精油；微膠囊；響應面法；穩定性

stability

花椒，屬于蕓香科落葉灌木植物，具有濃烈的芳香氣味[1]，其成熟果皮富含揮發油和脂肪。花椒具有溫中散寒、除濕、殺蟲和止痛等功效[2,3]，不僅是著名的香辛料和油料，而且也可以作為中藥材，在食品添加劑領域具有廣闊的應用性。花椒精油是指一類花椒源次生代謝物質，是花椒體內分子量較小、可隨水蒸氣蒸出、具有一定氣味的揮發性油狀液體物質，但在有氧、光照、濕度及溫度較高時化學性質不穩定，使其在食品中的應用受到限制[4]。近些年，人們通過大量的實驗對花椒精油的功效進行了研究，證明花椒精油具有殺蟲殺菌、抑殺蠕形螨、抗腫瘤、抗炎及鎮痛等作用[5-8]。我國花椒資源相當豐富，對其精油進行深入的加工和應用研究，對花椒的合理開發及利用具有深遠意義。

微膠囊是指一種具有聚合物壁殼的微型容器或包裝物[9]，直徑范圍為幾微米到上千微米，可以包埋一些敏感性強、揮發性高的物質，具有半透性或密封性。由于具有能夠改變物料的狀態、質量、體積和性能，保護敏感成分，增強穩定性，控制芯材釋放，降低或掩蓋不良味道，降低揮發性，隔離組分等功能，因此，微膠囊技術得到了快速發展和廣泛應用[10]。

微生物微膠囊是以微生物菌體為壁材，通過物理、化學等方法使芯材滲透擴散進入細胞內，即可形成可降解的微膠囊。這些真菌的細胞直徑大小約為幾十微米，分布均勻，其細胞壁具有可透性、無毒及降解性[11]。因此，它是包裹香精、食用色素、維生素、植物生長調節劑等多種物質的良好壁材[12,13]。人們曾先后對霉菌、酵母菌、原生蟲等各類微生物進行了對比研究，結果發現以酵母菌作為壁材的微膠囊包埋效果最好。酵母菌的細胞壁具有較強的韌度與柔軟度，即使經高壓、加熱或冷凍處理，被包埋的油脂、不飽和脂肪酸等仍十分穩定，耐加工性非常好，制得的微膠囊的直徑一般為5～8 μm，密度與水相近，在水中具有優良的分散性[14-16]。目前，現有的科學研究成果是以復合材料為壁材，利用乳化包埋、超聲、噴霧干燥等方法制備花椒精油微膠囊[17-19]，解決花椒精油易氧化、易揮發、貯存、運輸和加工等技術難題,但暫時還沒有對花椒精油微膠囊生物技術的研究，因此，本實驗以生香釀酒活性干酵母為壁材，包埋制備花椒精油微膠囊，選擇芯材比、包埋溫度和包埋時間3個因素，采用三因素三水平的Box-Behnken中心組合設計確定花椒精油微膠囊制備的工藝條件，為花椒精油的合理開發提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生香釀酒活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；花椒精油 廣州市姿匯化妝品有限責任公司；無水乙醇(分析純)、Tween80(分析純) 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器

DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；FJ200-SH型數顯高速分散均質器 上海標本模型廠；ZWY-110X30水浴恒溫振蕩器 上海智誠分析儀器有限公司；D-37520高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技公司；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；DZF-6050型真空干燥箱 上海三發科學儀器有限公司；JY92-ⅡD超聲波細胞粉碎機、DC-2006節能型智能恒溫槽 寧波新芝生物科技有限公司；UV-1800PC型掃描型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；JA3003電子天平 上海浦春計量儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 干酵母細胞預處理

在105 ℃條件下，將裝有安琪生香釀酒活性干酵母的稱量瓶敞口放置在電熱鼓風干燥箱內滅活1 h，冷卻至室溫后儲存備用。

1.3.2 花椒精油微膠囊制備

參照劉立志等[20]的研究并根據實際情況加以改進：將干酵母和蒸餾水按1∶8的配比，加入至50 mL離心管內，再按相應比例加入花椒精油，用8000 r/min的高速分散均質器均質10 s，然后以100 r/min的速度在一定溫度的水浴恒溫振蕩器中振蕩一定時間，花椒精油通過滲透擴散作用進入酵母細胞內，即形成微膠囊。取出離心管，加入等體積的80%的乙醇溶液，混合均勻，靜置30 min后，用離心機于600 r/min分離10 min，去除上層液體，將離心沉淀物真空抽濾并用無水乙醇沖洗2～3次，最后用真空干燥箱于60 ℃干燥12 h，即可得到花椒精油微膠囊。

1.3.3 單因素試驗

稱取滅活的干酵母壁材1 g，加入8 mL的蒸餾水，按質量比1∶1加入花椒精油于50 mL離心管內，經均質后，在60 ℃條件下包埋6 h，固定其他條件不變，研究不同芯材比(3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3)、不同包埋溫度(40～80 ℃)、不同包埋時間(2～10 h)對微膠囊包埋率的影響。

1.3.4 響應面試驗

為得到制備的最佳工藝條件，在單因素試驗結果的基礎之上，以芯材比、包埋溫度和包埋時間為試驗因素，以花椒精油包埋率為響應值，采用響應面分析法設計三因素三水平Box-Behnken實驗，見表1。

表1 試驗因素與水平

1.3.5 包埋率測定

1.3.5.1 繪制標準曲線

精確稱取花椒精油0.1～1 g，分別加入20 mL 3 g/L的Tween80水溶液，攪拌均勻2～3 min后移入50 mL容量瓶中，定容至刻度線，搖勻靜置，即可得一系列濃度梯度的標準溶液。采用紫外分光光度法，空白為3 g/L的Tween80水溶液，在300 nm處測定各標準溶液的吸光值，通過Excel分析，即可得花椒精油的標準曲線。

1.3.5.2 破壁提取花椒精油

稱取300 mg花椒精油微膠囊，并加入20 mL 3 g/L的Tween80水溶液至50 mL離心管內，用設定功率為270 W的超聲波細胞粉碎器超聲25 min，然后將溶液高速離心(12000 r/min，10 min，4 ℃)后取上層清液，用50 mL容量瓶定容。采用紫外分光光度法在300 nm處測定樣品溶液的吸光值，即可計算每一組花椒精油微膠囊的包埋率，計算公式如下：

W=M1/M2×100%。

式中：W為花椒精油微膠囊包埋率，%；M1為樣品中被包埋的花椒精油質量，g；M2為花椒精油微膠囊的樣品質量，g。

1.3.6 光學顯微觀察

取少量滅活的干酵母和花椒精油微膠囊，分別在兩個裝有蒸餾水的小燒杯中分散，制成菌懸浮液，用玻璃棒分別蘸取少量液體于載玻片上，蓋上蓋玻片，在光學顯微鏡下觀察其形態。

1.3.7 花椒精油微膠囊的穩定性

在(60±1) ℃的烘箱內，將裝有5 g花椒精油和包埋有5 g花椒精油的微膠囊的小燒杯分別敞口放置，每隔一段時間(4，8，16，32，48 h)稱重一次花椒精油的質量，取一次微膠囊樣品(約300 mg)，測其包埋率，研究花椒精油及其微膠囊的揮發性，計算公式如下：

W1=m0-m1/m0×100%；

W2=(W初-W測)×100%。

式中：W1為花椒精油揮發率，%；m0為花椒精油初始質量，mg；m1為花椒精油剩余質量，mg；W2為精油微膠囊揮發率，%；W初為精油微膠囊初始包埋率，%；W測為一定時間加熱后測得的精油微膠囊的包埋率，%。

2 結果與分析

2.1 花椒精油的標準曲線

按不同倍數稀釋花椒精油標品，得到的標準曲線方程為Y=0.0957X+0.0142，R2=0.9983，標準曲線見圖1。

圖1 300 nm處花椒精油的標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同芯材比對包埋率的影響

圖2 不同芯材比對包埋率的影響

由圖2可知，花椒精油微膠囊的包埋率隨著不同芯材比的變化趨勢為先升高后降低，其中，包埋率最高值出現在芯材比為1∶1時，值為65.32%，由于花椒精油經自由擴散進入酵母細胞[21]，隨著芯壁比增大，酵母細胞內花椒精油的含量也相應增大。因此，選擇芯材比為1∶1時包埋效果最理想。

表2 單因素分析計算結果

由表2可知，F=7.32>Fcrit=5.19,所以在顯著性水平0.05下拒絕原假設，即不同芯材比對包埋率有顯著的影響。

2.2.2 不同溫度對包埋率的影響

圖3 不同溫度對包埋率的影響

由圖3可知，在40～60 ℃內，隨著包埋溫度升高，精油分子在溶液中的運動速度隨溫度升高而加快，且向酵母內部擴散速度也隨之增加，所以包埋率呈上升趨勢，但當溫度超過60 ℃，可能是由于在持續高溫條件下，酵母細胞壁的性質發生改變，造成了部分精油的揮發損失和氧化，從而導致包埋率下降。不同溫度對花椒精油微膠囊的包埋率影響較顯著，則選擇60 ℃為花椒精油微膠囊制備的最佳溫度。

表3 單因素分析計算結果

由表3可知，F=15.05>Fcrit=5.19,所以在顯著性水平0.05下拒絕原假設，即不同溫度對包埋率有顯著的影響。

2.2.3 不同時間對包埋率的影響

圖4 不同時間對包埋率的影響

由圖4可知，隨著包埋時間增加，包埋率呈增長趨勢，但包埋時間超過8 h后，包埋率開始下降。考慮到在高溫條件下長時間作用，可能造成精油揮發損失或者一些物質性質發生改變，因此，選擇6～10 h左右包埋時間最合適。

表4 單因素分析計算結果

由表4可知，F=4.56

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計及結果

根據Design Expert(8.0版)統計分析軟件，可得三因素三水平的中心組合設計包括15個試驗方案，具體的試驗方案及實驗結果見表5。

表5 響應面設計及結果

2.3.2 回歸方程的建立

根據表5結果利用Design Expert(8.0版)軟件，可得二次多項回歸方程為：Y=68.27-2.86A+3.50B+0.49C-0.97AB+9.25AC-2.53BC-8.61A2-4.78B2-9.81C2。

表6 回歸方程系數顯著性檢驗

注：“**”表示差異極顯著(P<0.01)；“*”表示差異顯著(P<0.05)。

由表6可知，回歸模型中顯示了因素間的交互作用，其中B，AC，A2，C2極顯著。由F值可知，影響精油微膠囊包埋率的各因素大小順序為包埋溫度>芯材比>包埋時間，其中包埋溫度對包埋率影響達到極顯著水平(P<0.01)。

表7 方差分析

由表6和表7 可知，所建立的二次回歸方程具有極顯著性(P=0.0018<0.01)，失擬項0.8050>0.05，不顯著。模型的回歸系數 R2=0.9745，校正決定系數R2=0.9286,表示該模型擬合程度較好，試驗誤差較小，可以用此模型對花椒精油微膠囊制備工藝進行分析和預測。

2.3.3 因素的交互作用對包埋率的影響

a芯材比和包埋溫度的響應面

b芯材比和包埋溫度的等高線圖

c芯材比和包埋時間的響應面

d芯材比和包埋時間的等高線圖

e包埋溫度和包埋時間的響應面

f包埋溫度和包埋時間的等高線圖

響應曲面的坡度可表示試驗因素對響應值的影響大小，坡度相對陡峭，則因素對響應值影響較大；反之，坡度相對平緩，則因素對響應值影響較小。而等高線的形狀可反映出交互效應的強弱大小，形狀呈圓形，則兩因素交互作用顯著，形狀呈橢圓形，則兩因素交互作用可忽略。由圖5中a和b可知，在一定時間內，包埋率隨芯材比增加的變化趨勢為先升高后降低，隨包埋溫度增加而增加，且增加速率逐漸減少，包埋率隨包埋溫度變化的曲面坡度較其隨芯材比變化的曲面坡度陡峭，但整體所呈現的響應曲面坡度相對平緩，且等高線圖呈圓形，則說明芯材比和包埋溫度對包埋率的交互作用并不顯著。

由圖5中c和d可知，在一定溫度條件下，包埋時間和芯材比所形成的響應曲面相對陡峭，且等高線呈橢圓形，則表示芯材比和包埋時間對包埋率的交互作用顯著。由圖5中e和f可知，在相同的芯材比情況下，包埋率隨包埋溫度的變化趨勢與圖5中a相似，且包埋率隨包埋溫度變化的曲面坡度較其隨包埋時間變化的曲面坡度陡峭，因此綜上可得，包埋溫度對包埋率的影響最大，包埋時間和芯材比對包埋率的交互作用最顯著，且與表6統計結果一致。

2.3.4 驗證試驗

由回歸方程可得最佳工藝條件：芯材比為1∶1.139，包埋溫度為64.38 ℃，包埋時間為7.674 h，包埋率預測值可達到69.39%。考慮到實際操作，將試驗條件修正為：芯材比1∶1，包埋溫度64 ℃，包埋時間8 h，進行3次驗證試驗，得包埋率的平均值為68.71%，與預測值69.39%接近，表示利用響應面優化得到的模型工藝參數準確可靠。

2.4 微膠囊形貌觀察

在顯微鏡×600下觀察到的花椒精油微膠囊的形狀為圓形或橢圓形，體積大于普通的酵母細胞，能明顯觀察到精油與壁材分離，見圖6。

圖6 顯微鏡下的花椒精油微膠囊

2.5 花椒精油微膠囊的穩定性

圖7 微膠囊化對精油揮發率的影響

由圖7可知，花椒精油和花椒精油微膠囊隨加熱時間的延長都有不同程度的揮發損失，且兩者的揮發速率不同，精油揮發率的增加趨勢明顯大于微膠囊的增加趨勢，由此可得，花椒精油微膠囊有效減少了精油的揮發損失，具有一定的穩定性，起到緩釋的作用。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，采用響應面法可得二次多項回歸方程為：Y=68.27-2.86A+3.50B+0.49C-0.97AB+9.25AC-2.53BC-8.61A2-4.78B2-9.81C2，最佳制備工藝條件：芯材比為1∶1，包埋溫度為64 ℃，包埋時間為8 h，包埋率為68.71%，與預測值69.39%接近。通過實驗結果的方差分析可知，各因素對花椒精油微膠囊的包埋率的影響程度依次為：包埋溫度>芯材比>包埋時間，其中包埋溫度呈極顯著影響，芯材比呈顯著影響，包埋時間和芯材比之間存在極顯著的交互作用。緩釋規律研究結果顯示：在60 ℃條件下加熱48 h，精油微膠囊的揮發率為10.82%，低于精油的揮發率27.14%，說明酵母壁材對具有揮發性的花椒精油進行有效地密封，具有一定的穩定性，對精油起到保護的作用。

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Optimization of the Preparation Technology for Microencapsule ofZanthoxylumbungeanumOil Embedded with Yeast by Response Surface Methodology

LIU Xin1, CHEN Hong-yu2, LI Zeng-wei2, ZENG Yue2, CHEN Shu-juan2, CHEN Sha-sha3

(1.Heilongjiang Institute for Food and Drug Control, Harbin 150088,China;2.College of Food Science,Sichuan Agricultural University, Ya'an 625014,China;3.Heilongjiang Centre Testing International Corporation, Harbin 150025,China)

Use vibrant wine active dry yeast as wall material for embeddingZanthoxylumbungeanumoil, and use Box-Behnken central composite design and response surface analysis methodology to study the effect of embedding temperature,embedding time and core-material ratio on embedding rates ofZanthoxylumbungeanumoil microcapsule. The results of experiment show that the embedding temperature is 64 ℃, the embedding time is 8 h, core-material ratio is 1∶1, and the average embedding rate ofZanthoxylumbungeanumoil is 68.71%, which is consistent with the theory predictive value of 69.39%. Through slow release test, microcapsule can reduce the release rate of fragrance ofZanthoxylumbungeanumoil, and it has good stability.

wine active dry yeast；Zanthoxylumbungeanumoil；microcapsule；response surface methodology；

2017-02-21

劉鑫(1984-)，女，工程師，碩士，研究方向：食品藥品安全與檢驗。

TS202.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.013

1000-9973(2017)06-0061-06