克氏原螯蝦蛋白肽的制備及其抗氧化性的研究

趙利，李婷，汪清，胡火根，陳麗麗，袁美蘭

(1.江西科技師范大學 生命科學學院 國家淡水魚加工技術研發分中心，南昌 330013；2.江西省水產技術推廣站，南昌 330046)

克氏原螯蝦蛋白肽的制備及其抗氧化性的研究

趙利1，李婷1，汪清1，胡火根2，陳麗麗1，袁美蘭1

(1.江西科技師范大學 生命科學學院 國家淡水魚加工技術研發分中心，南昌 330013；2.江西省水產技術推廣站，南昌 330046)

以克氏原螯蝦副產物為原料，利用生物酶技術提取其中的蛋白肽，采用正交試驗優化工藝，并對蛋白肽進行抗氧化性研究及氨基酸組成成分分析。結果表明：克氏原螯蝦蛋白肽最優制備工藝為堿性蛋白酶，酶解時間3 h，酶解溫度55 ℃，料液比1∶20，pH值9.0，加酶量2.5%，在此條件下，蛋白質水解度達到最大值，為67.51%。蛋白肽的還原能力及羥基自由基清除能力較強，而DPPH自由基清除能力弱。蛋白肽中所含氨基酸豐富，其中人體所需的必需氨基酸占氨基酸總量的47.4%，呈味氨基酸(尤其是谷氨酸、天冬氨酸)的含量較多。

克氏原螯蝦；酶法水解；抗氧化性；氨基酸

近年來，隨著生活水平的提高，克氏原螯蝦因其味道鮮美，蛋白質、礦物質含量豐富，營養價值高而越來越受到人們的歡迎[1]。隨著市場上克氏原螯蝦需求量的增加，在其加工和消費過程中，產生的蝦頭和蝦殼等副產物也會大幅度增加。常用的處理方法是進行魚粉飼料加工[2，3]，但附加值較低，故對于克氏原螯蝦副產物的有效利用已成為研究的一個熱點。

克氏原螯蝦蝦頭及其副產物是良好的蛋白質來源，采用酶解法來提取蛋白質，具有易于控制、反應溫和、對氨基酸破壞小等特點。鄭捷等以蝦副產物為原料，通過酶解工藝制備復合調味料[4]，香味濃郁、味道鮮美；隋偉[5]、王燕[6]、段衫等利用酶解法提取蛋白質，為克氏原鰲蝦副產物的綜合利用提供技術支持。

許多食品在加工過程中，容易發生氧化作用，而氧化會影響感官品質、降低營養，甚至產生有毒物質[7]。研究發現：龍蝦副產物經過水解產生的蛋白肽具有良好的抗氧化能力，為了有效地抑制氧化作用，眾多研究者致力于蛋白肽抗氧化性的研究，以期從中找尋制備抗氧化劑的原料。此外，眾多資料表明：蝦類、貝類、魚類等水產動物中氨基酸十分豐富[8]，存在著大量的谷氨酸、丙氨酸等，所含蛋白質經過酶解后，營養價值并不會降低[9，10]，然而對蛋白酶解后氨基酸種類及含量變化的研究鮮有報道。

本實驗以克氏原螯蝦副產物為原料，利用酶解法進行蛋白肽提取工藝的優化，并對酶解后的蛋白肽進行抗氧化性質研究以及氨基酸成分分析，為蝦副產物綜合利用的新途徑提供理論依據，對增加克氏原螯蝦副產物的綜合利用率、提高經濟效益有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

克氏原螯蝦副產物 江西海浩鄱陽湖水產有限公司；木瓜蛋白酶Papain 南京龐博生物工程有限公司；堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 FG)、風味蛋白酶(Flavourzyme 500 MG)、中性蛋白酶(Neutrase 1.5 MG)、復合蛋白酶Protamex 丹麥諾維信有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH) 美國Sigma公司；氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸等試劑均為分析純，購于南康市華億化工有限公司。

JJ-2高速組織搗碎機 上海標本模型廠；DELTA-320精密pH計 梅特勒-托利多國際有限公司；85-1磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；TDL-5A離心機 上海費洽爾分析儀器有限公司；UT-12電熱鼓風干燥箱 上海三發科學儀器有限公司；SX2-4-10箱式電爐 上海嘉益電爐有限公司；UV-1000型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理

將蝦殼副產物在電熱鼓風干燥箱中50 ℃烘干，粉碎機粉碎，密封保存于干燥環境中以備用。

1.2.2 蝦殼基本成分測定

水分測定：直接干燥法，參考GB 5009.3-2010；灰分測定：550 ℃干法灰化法，參考GB 5009.4-2010；脂肪測定：索式提取法，參考GB/T 14772-2008；總糖測定：分光光度法，參考GB/T 9695.31-2008；粗蛋白質含量：凱氏定氮法，參考GB 5009.5-2010。

1.2.3 蛋白質酶解工藝

1.2.3.1 不同蛋白酶對蝦副產物蛋白質水解度的影響

稱取5 g蝦殼粉，分別選取木瓜蛋白酶Papain、中性蛋白酶Neutral Protease、堿性蛋白酶Alcalase、風味蛋白酶Flavourzyme、復合蛋白酶Protamex進行實驗，調節體系分別維持在各蛋白酶的最適pH值、最適酶解溫度，料液比均為1∶10，加酶量為蝦殼粉蛋白質含量的2%，酶解3 h后沸水浴滅酶10 min，離心(4000 r/min，10 min)，測定上清液中的蛋白質含量。5種蛋白酶的酶解條件見表1。

表1 5種蛋白酶的酶解條件

1.2.3.2 蛋白質水解度測定

三氯乙酸(TCA)沉淀法[11-13]。取10 mL上清液于離心管中，加入等量的15% TCA溶液，混勻，室溫下靜置30 min，離心(5000 r/min，15 min)，取全部上清液測其蛋白質含量，按式(1)計算蛋白質水解度。

(1)

1.2.3.3 不同酶解條件對水解度的影響

選取最優蛋白酶后，采用單因素實驗研究酶解時間、酶解溫度、pH值、料液比、加酶量對蝦殼蛋白質水解度的影響。在單因素實驗的基礎上，設計正交實驗進行酶解工藝的優化，單因素實驗設計見表2。

表2 單因素實驗設計

1.2.4 蛋白肽的抗氧化性測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力

取2 mL樣品溶液和2 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合，在室溫下避光放置30 min，于517 nm下測其吸光度A1(用70%的乙醇溶液調零)；同時，測定樣品溶液與70%乙醇反應后的吸光度A2，以及測定DPPH-乙醇溶液與70%乙醇反應后的吸光度A3作為空白實驗，DPPH自由基清除率按式(2)計算。

清除率=[1-(A1-A3)/A2]×100%。

(2)

1.2.4.2 羥自由基(·OH)清除能力測定

依次加入1 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵、1 mL樣品溶液、1 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，37 ℃水浴30 min，510 nm下測吸光度A1；同時，用等量的蒸餾水代替樣品溶液，進行如上步驟，測其吸光度A2；以1 mL蒸餾水代替水楊酸-乙醇溶液作為對照，測其吸光度A3，羥自由基(·OH)清除率按式(3)計算。

清除率=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

(3)

1.2.4.3 還原力的測定

于試管中加入1 mL樣品，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH為6.6)、2.5 mL 1% 鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴鍋中靜止20 min后冷卻至室溫，加入10% TCA 2.5 mL，離心(3000 r/min，10 min)，取2.5 mL上清液加入0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液和2.5 mL蒸餾水，反應15 min后，于700 nm處測吸光值。

1.2.5 蛋白肽中氨基酸成分測定

氨基酸自動分析儀法，參照GB/T 5009.124-2003。準確稱取一定量酶解液(使蛋白質含量在10～20 mg范圍內)，加入15 mL 6 mol/L HCl，抽真空充氮氣，封口后置于110 ℃恒溫干燥箱水解22 h，取出冷卻、過濾、定容至50 mL，吸取濾液1 mL定容至5 mL，在40 ℃的真空干燥器中干燥，加入1 mL pH為2.2 的緩沖液進行溶解，準確吸取0.200 mL用緩沖液稀釋至5 mL，用氨基酸自動分析儀檢測氨基酸含量。

2 結果與分析

2.1 蝦副產物的基本成分

克氏原螯蝦副產物基本成分含量見表3。由于原料經過烘干處理，故水分含量較低，為7.46%，粗蛋白及礦物質含量豐富，分別為33.67%和36.18%。

表3 蝦副產物中成分含量

2.2 蝦副產物中蛋白質酶解工藝的優化

2.2.1 最優蛋白酶的選擇

選取風味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶在其最佳水解條件下進行酶解，測定上清液中蛋白質含量，計算水解度，結果見圖1。

圖1 不同蛋白酶對蝦副產物中蛋白質水解度的影響

由圖1可知，風味蛋白酶、木瓜蛋白酶以及中性蛋白酶的水解效果均較差，水解度低，復合蛋白酶的酶解效果稍優于前3種，水解度為30.79%，堿性蛋白酶的水解效果最好，水解度達到了50.17%，原因可能是堿性蛋白酶具有較強的水解能力和耐堿能力，有較大的耐熱性，且具有一定的酯酶活力[14]，故其水解度最大。本實驗選擇堿性蛋白酶為最優蛋白酶。

2.2.2 酶解時間對水解度的影響

在酶解溫度為55 ℃，pH為8.5，加酶量為2.5%，料液比為1∶10的條件下，分別酶解1，2，3，4，5 h，測定上清液中蛋白質含量，計算水解度，結果見圖2。

圖2 酶解時間對水解度的影響

由圖2可知，在一定的酶解時間內，水解度隨著時間的延長而增大，2～3 h水解度顯著增加，酶解3 h以后，水解度增加逐漸趨于緩慢，4 h后開始下降。說明剛開始時，隨著酶解時間的延長，蛋白質與酶的反應越來越充分，分解出的短肽增多，水解度增大；4 h時，蛋白質與酶反應完全，水解度達到最大；而后，由于酶長時間工作后會出現鈍化現象，催化能力降低，故水解度略有下降?？紤]到生產周期越長會使生產成本增加，故合理選取酶解時間為3 h。

2.2.3 酶解溫度對水解度的影響

在酶解時間為3 h，pH為8.5，加酶量為2.5%，料液比為1∶10的條件下，分別設置酶解溫度為45，50，55，60，65 ℃，測定上清液中蛋白質含量，計算水解度，結果見圖3。

圖3 酶解溫度對水解度的影響

由圖3可知，酶解溫度在45～55 ℃范圍內水解度顯著增加，55 ℃時達到最大，為57.12%，而后隨著酶解溫度的升高，水解度急劇下降，酶解溫度為65 ℃時水解度僅為34.7%。分析原因：每種酶都有其最適反應溫度，在一定的溫度范圍內，溫度升高使酶的活化分子含量提高，加速酶與蛋白質之間的酶解反應速率，但酶的本質是蛋白質，溫度過高可以使酶發生變性，減少活性酶的含量，水解度隨之下降，故選用酶解溫度為55 ℃較合適。

2.2.4 pH值對水解度的影響

在酶解時間為3 h，酶解溫度為55 ℃，加酶量為2.5%，料液比為1∶10的條件下，分別調節體系pH為7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，測定上清液中蛋白質含量，計算水解度，結果見圖4。

圖4 pH值對水解度的影響

由圖4可知，水解度隨著pH的增大呈現先升高后下降的趨勢，在8.5～9.0之間達到最大，說明此處的pH值為堿性蛋白酶的最適pH，pH過小或過大，都會使蛋白酶變性失活，同時也會影響酶與底物的結合，從而使水解度降低。由于pH 8.5時水解度為58.74%，高于pH為9.0時的水解度(58.04%)，因此，本實驗選用酶解最佳pH為8.5。

2.2.5 料液比對水解度的影響

在酶解時間為3 h，酶解溫度為55 ℃，pH為8.5，加酶量為2.5%的條件下，分別調節料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，測定上清液中蛋白質含量，計算水解度，結果見圖5。

圖5 料液比對水解度的影響

由圖5可知，水解度隨著溶劑的增加先升高后降低，但均處于53%～60%之間，波動范圍不大。料液比為1∶20(g/mL)時，水解度達到最大，隨后底物濃度逐漸變小，不利于堿性蛋白酶與蛋白質的結合，導致水解度降低，故選用1∶20為最佳料液比。

2.2.6 加酶量對水解度的影響

在酶解時間為3 h，酶解溫度為55 ℃，pH為8.5，料液比為1∶20的條件下，分別加酶1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，測定上清液中蛋白質含量，計算水解度，結果見圖6。

圖6 加酶量對水解度的影響

由圖6可知，隨著加酶量的增加，水解度顯著升高，加酶量為2.5%時達到最大，而后趨于平緩。原因可能是在一定范圍內，隨著酶濃度的增加，酶與底物中蛋白質的結合位點增多，酶解作用增強，當達到一定濃度后，酶與蛋白的結合位點達到飽和，水解度達到最大，但由于底物濃度固定，故繼續增加酶濃度，酶解效果不會有很大變化，故本實驗加酶量選用2.5%。

2.2.7 堿性蛋白酶水解蛋白質正交實驗設計及結果

通過單因素實驗，我們確定了最優蛋白酶為堿性蛋白酶，最佳酶解溫度為55 ℃，酶解時間為3 h，pH值為8.5，加酶量為2.5%，料液比為1∶20。在此基礎上，選擇酶解溫度、pH值、加酶量、料液比為實驗因素，設計L9(34)正交實驗，進行酶解工藝的優化。正交實驗設計及結果見表4。

表4 正交實驗設計及結果

續 表

通過正交實驗結果及極差分析可知，各因素對蛋白質水解度影響不同，其主次順序為C(加酶量)>A(料液比)>B(pH值)>D(酶解溫度)，最優的酶解條件組合為A2B3C2D2，但此結果與單因素實驗探究出的最佳酶解條件組合(A2B2C2D2)不一致，故需要做驗證實驗。結果證明：在此條件(A2B3C2D2)下進行酶解，水解度為67.51%，高于其余任何一組。故確定最優的酶解工藝條件為A2B3C2D2組合，即料液比1∶20，pH值9.0，酶解溫度55 ℃，加酶量2.5%，酶解時間3 h。

2.3 蛋白肽的抗氧化性

2.3.1 蛋白肽的還原力

還原能力主要是反映抗氧化劑通過轉移電子還原一些組分的能力。

圖7 蝦蛋白肽的還原能力

由圖7可知，在實驗范圍內(0.2～1.2 mg/mL)，吸光度隨著濃度的增加而升高，且呈現良好的線性關系(y=0.48402x+0.00852，R2=0.99551)，李松林在研究克氏原螯蝦蛋白肽的抗氧化活性時也得出了相似的結論。蛋白肽濃度為1.0 mg/mL時，700 nm處的吸光度值為0.4925，張風等研究凡納濱對蝦蛋白肽的還原能力時測得的吸光度相近[15]，說明克氏原螯蝦與凡納濱對蝦蛋白肽的還原能力相當。

2.3.2 蛋白肽的DPPH自由基清除率

DPPH自由基(二苯基苦味?；杂苫?是一種很穩定的自由基，可以捕獲其他自由基，在520 nm處有強烈的吸收能力[16，17]，溶液呈深紫色，被廣泛應用于抗氧化性的研究中。

圖8 蝦蛋白肽的DPPH自由基清除能力

由圖8可知，在本實驗濃度范圍內，蝦殼蛋白肽對DPPH自由基的清除能力并不呈線性關系，其清除率隨著蛋白肽濃度的增加先升高后略有下降。蛋白肽濃度為0.4 mg/mL時清除率最大，為43.07%，王繼宏等發現：南極磷蝦蛋白酶解物的DPPH自由基清除率可達72.7%[18]，說明在本實驗的酶解條件下，克氏原螯蝦蛋白肽清除DPPH自由基的能力較弱。

2.3.3 蛋白肽的羥自由基(·OH)清除率

圖9 蝦蛋白肽的羥基自由基清除能力

羥自由基是一種重要的活性氧，氧化性僅次于氟。由圖9可知，蛋白肽對羥自由基的清除率隨著濃度的增大而增加，在濃度為1.2 mg/mL時清除率為85.87%，并依舊呈現上升的趨勢。楊玉孌等研究河蜆水溶性蛋白時，清除率最高僅達26.33%[19]；林麗英等在南美白對蝦最優酶解條件下，測得清除率為68.43%[20]，表明克氏原螯蝦蛋白肽具有較好的羥基自由基清除能力。

2.4 氨基酸成分分析

表5 蝦蛋白肽的氨基酸組成

注：“*”為必需氨基酸。

由表5可知，利用氨基酸自動分析儀，共檢測了17種氨基酸，種類較齊全。氨基酸總含量為4.897%，必需氨基酸比例較高，占氨基酸總量的47.4%，非必需氨基酸占52.6%。呈味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸)含量也較豐富，占氨基酸總量的40.9%，它能夠提高原料的鮮味和甘味，可用來開發海鮮調味料。

其中，谷氨酸的含量最高，為0.825%，占氨基酸總量的16.85%，谷氨酸鮮味很強，被人體吸收后參與蛋白質的代謝過程，可治療肝性昏迷以及改善智力等。天冬氨酸含量為0.557%，占總氨基酸含量的11.29%，天冬氨酸雖然屬于非必需氨基酸，但它是多種氨基酸合成的前體，對于蛋白質的合成發揮著重要的作用。此外，纈氨酸和賴氨酸的含量也較高，分別占氨基酸總量的8.597%和7.944%，對提高兒童智力、促進身體發育有重要意義。

王曜、陳舜勝等在研究克氏原螯蝦蝦頭中的氨基酸組成時發現，必需氨基酸占總氨基酸含量的45.7%，呈味氨基酸占總氨基酸含量的33.3%，對比表5可知，蛋白酶解后必需氨基酸和呈味氨基酸含量并未降低，且天冬氨酸、谷氨酸含量顯著升高。張祥剛等人研究了南美白對蝦蝦殼、蝦頭的營養成分[21，22]，通過比較，發現克氏原螯蝦與南美白對蝦中必需氨基酸含量均較齊全，占氨基酸總量的比例相近，但南美白對蝦中提供鮮味的主要為甘氨酸，而克氏原螯蝦中主要為谷氨酸，且所含的精氨酸含量低于南美白對蝦。

3 結論

采用酶解法酶解克氏原螯蝦蝦頭、蝦殼中的蛋白質制備蝦蛋白肽，酶為堿性蛋白酶，最佳酶解工藝為酶解時間3 h，料液比1∶20，pH值9.0，酶解溫度55 ℃，加酶量2.5%，在此條件下蛋白質的水解度為67.51%。

通過蝦蛋白肽的抗氧化性研究，發現其還原能力較強，700 nm處吸光度與蛋白肽濃度呈良好的線性關系；清除羥自由基的能力也很強，清除率隨著濃度增大一直呈上升趨勢；但DPPH自由基清除能力較弱，最大僅為43.07%。

蝦蛋白肽中氨基酸含量豐富，人體所需的必需氨基酸也較齊全，呈味氨基酸(尤其是谷氨酸、天冬氨酸)的含量較多，對于兒童的生長發育起著重要的作用，且有利于蝦味調料品的研究。

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Research on Preparation and Antioxidant Activity of Crayfish Protein Peptide

ZHAO Li1， LI Ting1， WANG Qing1， HU Huo-gen2， CHEN Li-li1， YUAN Mei-lan1

(1.Chinese Freshwater Fish Processing Technology Research and Development Branch，School of Life Science，Jiangxi Science & Technology Normal University，Nanchang 330013，China；2.Jiangxi Fisheries Technology Promotion Station，Nanchang 330046，China)

Proteins are extracted from crayfish by-products by enzyme technology in this research. Orthogonal array design is used to gain the optimal parameters of processing. Moreover, the antioxidant potential and amino acid composition of protein peptides from crayfish are investigated. The results show that alcalase is selected to prepare crayfish by-products hydrolysate, the optimal hydrolysis conditions are hydrolysis time of 3 h, hydrolysis temperature of 55 ℃, solid-liquid ratio of 1∶20, hydrolysis pH of 9, and enzyme additive amount of 2.5%.Under the optimal hydrolysis conditions, the hydrolysis degree is up to 67.51%, which is the highest. Moreover, the scavenging activity against hydroxyl radical and reducing capacity of the extracts are strong, but the DPPH scavenging activity is weak. There are numerous kinds of amino acids in protein peptides, the essential amino acids that human body needed account for 47.4% in the total amino acids, and the content of flavor amino acids(especially glutamic acid, aspartic acid) is more.

crayfish; enzymatic hydrolysis; antioxidant activity;amino acid

2017-01-16

農業部公益性項目(201003070)；江西科技師范大學第十屆本科生科研基金項目(國家級)(201611318004)

趙利(1967-)，女，教授，博士，研究方向：食品化學。

TS254.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.005

1000-9973(2017)06-0022-07