強化供氧對巴氏醋桿菌醋酸發酵及胞內ATP濃度的影響

殷海松，張仁寬，白曉磊，鄭宇，王敏*

(1.天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.天津現代職業技術學院 生物工程學院，天津 300350)

強化供氧對巴氏醋桿菌醋酸發酵及胞內ATP濃度的影響

殷海松1,2，張仁寬1，白曉磊1，鄭宇1，王敏1*

(1.天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.天津現代職業技術學院 生物工程學院，天津 300350)

溶氧對巴氏醋桿菌醋酸發酵有顯著影響，但是目前溶氧對醋酸發酵影響的機理尚不十分清楚，文章通過提高攪拌轉速，探討強化供氧對巴氏醋桿菌醋酸發酵影響的機理。研究結果顯示：攪拌轉速從500 r/min增加到700 r/min后，胞內ATP濃度提高了302%；乙醇氧化偶聯呼吸鏈產能途徑關鍵酶ADH，ALDH和ATPase 酶活性分別提高了40%，60%和56%。當發酵28 h時，轉速700 r/min與500 r/min相比菌體濃度提高了37%，產酸量提高了150%，單位菌體產酸提高了84%。由此可知，巴氏醋桿菌菌體生長和醋化乙醇過程中需要消耗大量的溶氧，尤其在16～28 h產酸高峰期對溶氧的消耗更大。提高攪拌轉速強化供氧可顯著提高巴氏醋桿菌乙醇氧化偶聯呼吸鏈產能途徑關鍵酶的活性，強化乙醇氧化產酸和乙醇呼吸鏈途徑產能，為巴氏醋桿菌菌體生長和產酸提供更多的能量，滿足菌體快速生長和適應高酸生存環境對能量的需求，提高菌體對醋酸的耐受性，從而提高菌體濃度和產酸速率。

巴氏醋桿菌；供氧；轉速；醋酸；ATP濃度

食醋是一種常見的酸味調味品，醋酸是其主要組分。醋酸菌是能將乙醇氧化成醋酸的一類微生物的總稱，其中Acetobacter屬由于具有很強的乙醇氧化能力，被廣泛應用于食醋發酵[1-3]。醋酸對普通微生物具有較強的毒性，醋酸菌具有特殊的機制，能夠耐受較高濃度的醋酸。在醋酸發酵過程中，胞內能量的高低對菌體的醋酸耐受性有重要影響。Nakano S等研究表明，醋酸分子的泵出機制和ATP依賴型的轉運蛋白，如AatA和ClpB均與菌體的能量代謝直接相關[4-7]，因此，能量供應對于保障巴氏醋酸桿菌在高酸環境下的正常代謝非常重要[8]。所以，強化ATP的供應是提高代謝產物的產量和抵御不良生存環境的重要手段[9-11]。醋酸菌是好氧菌，在其醋酸發酵過程中需要消耗大量的溶氧，醋酸發酵過程的耗氧主要由菌體生長耗氧和乙醇的醋化耗氧兩部分組成，因此在醋酸發酵過程中必須不斷供氧[12]。在有氧的條件下，微生物主要通過氧化磷酸化途徑產生ATP[13]。在醋酸發酵過程中，菌體需要有氧呼吸來提供抵御高酸環境的能量[14]。巴氏醋桿菌有氧呼吸產能途徑主要有乙醇呼吸鏈產能途徑和TCA循環偶聯呼吸鏈產能途徑。

本文通過提高攪拌轉速，探討強化供氧對巴氏醋桿菌醋酸發酵影響的機理，研究成果將有助于通過控制氧氣的供應控制胞內ATP濃度，指導醋酸發酵工藝優化與調控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)AC2005，由中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)保藏(保藏編號：CGMCC3089)。

1.1.2 培養基

斜面培養基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏15，碳酸鈣20，瓊脂17，pH自然，121 ℃滅菌20 min，冷卻至60 ℃左右，加入無水乙醇至28，搖勻后分裝斜面。

種子培養基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏15，pH自然，121 ℃滅菌20 min，接種前加入無水乙醇至28。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨5，天冬氨酸0.2，pH自然，121 ℃滅菌20 min，接種前加入無水乙醇至56。

1.1.3 試劑

無水葡萄糖(分析純) 天津福晨化學試劑廠；蛋白胨生化試劑 英國Oxiod公司；酵母膏生化試劑 北京奧博星生物技術有限責任公司；天冬氨酸生化試劑 美國Biotopped進口分裝。

1.2 儀器與設備

UVmini-1250紫外/可見分光光度計 日本島津公司；HYG-W1搖床 上海欣蕊自動化設備有限公司；YJ-875S醫用超凈臺 蘇州凈化設備廠；Multiskan Ascent酶標儀 Thermo 公司；TGL-16B 高速離心機 上海安亭科學儀器廠；Multifors Bacteria四聯平行發酵罐 瑞士INFORS公司。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

1.3.1.1 種子培養

將斜面保藏的菌種接種1環至盛有40 mL種子培養基的250 mL三角搖瓶中，置于30 ℃搖床中，在180 r/min下震蕩培養約27 h，當OD610=1.38±0.12時，轉接入發酵罐中。

1.3.1.2 四聯平行發酵罐發酵培養

將OD610=1.38±0.12的種子液以10%的接種量接種于發酵培養基(1 L四聯平行發酵罐，700 mL裝液量)中，培養溫度30 ℃，發酵罐轉速分別為500，600，700 r/min，通氣量0.7 vvm條件下培養，檢測發酵過程菌體濃度和醋酸濃度，當發酵液中酒精濃度低于0.5%(V/V)時，發酵結束。

1.3.2 提高攪拌轉速對巴氏醋桿菌醋酸發酵的影響

按10%的接種量將種子液轉接到發酵培養基中，控制四聯平行發酵罐轉速500，600，700 r/min，進行醋酸發酵，檢測發酵過程中菌體和醋酸濃度。

1.3.3 提高攪拌轉速對巴氏醋桿菌乙醇呼吸鏈途徑產能的強化及對關鍵酶活性的影響

按10%的接種量將種子液轉接到發酵培養基中，控制四聯平行發酵罐轉速500，600，700 r/min，進行醋酸發酵。收集菌體，分析其胞內ATP濃度和乙醇呼吸鏈關鍵酶ADH，ALDH和ATPase酶活性。

1.3.4 分析檢測方法

1.3.4.1 菌體干重

將發酵液于6000 r/min離心10 min，除去上清液，將菌體細胞置于干燥箱中，37 ℃恒溫烘干至恒重，稱量，根據標準曲線計算菌體干重。

1.3.4.2 醋酸濃度

酸堿滴定法：取1 mL發酵液于250 mL三角瓶中，加入蒸餾水15 mL，以酚酞作指示劑，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液將發酵液滴定至粉紅色，測得總酸含量。

1.3.4.3 ADH和ALDH酶活的測定

參照Wood法[15]，取Mcllains緩沖液0.5 mL，10% Triton X-100溶液0.1 mL，1 mol/L乙醇(乙醛)溶液0.1 mL，發酵液0.2 mL，0.1 mol/L鐵氰化鉀溶液0.1 mL，置于25 mL比色管中，25 ℃下保溫5 min，然后加入硫酸鐵-Dupanol溶液0.5 mL，加入3.5 mL蒸餾水混合后，在25 ℃條件下放置20 min(同時做空白對照)，在660 nm下測定吸光度值。

1.3.4.4 ATPase 酶活測定方法

透性細胞制備：25 mL培養液冷凍離心，加75 mmol的Tris-HCl buffer(pH 7.0，含10 mmol/L MgSO4)，加入甲苯，之后在預冷的乙醇中(-80 ℃)進行2次循環冷凍，之后30 ℃解凍。離心收集，之后在1 mL的75 mmol/L的Tris-HCl buffer(pH 7.0，含10 mmol/L MgSO4)中重懸，在預冷的乙醇中冷凍，-70 ℃保存待測。

ATPase酶活測定參考Matsumoto等[16]的方法。0.1 mL ATP(30 mmol/L)+0.4 mL反應液(3.75 mmol/L MgCl2，100 mmol/L KCl，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2)置于試管中，30 ℃保溫5 min，加入透性細胞懸浮液0.5 mL，再保溫30 min，加入0.2 mL 三氯乙酸(20%，W/V)中止反應，6000×g離心10 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL硫酸亞鐵-鉬酸銨。反應10 min，顏色變藍后，在660 nm處測吸光值。根據磷(Pi)標準曲線求出其含量，酶的活性單位為μmol(Pi)/[g (cells)·min]。

1.3.4.5 菌體胞內ATP濃度的測定

收集菌體，用空培養基洗滌3次，利用BacTiter-GloTM微生物細胞活性檢測試劑盒(G8230)(Promega公司)測定菌體胞內ATP濃度，檢測方法參照說明書。

1.3.4.6 溶解氧濃度的測定

采用溶解氧電極測定發酵過程的溶解氧濃度(DO)。電極的標定程序：室溫、1個標準大氣壓下飽和亞硫酸鈉溶液中的溶解氧濃度(DO)標定為零點；滅菌后、接種前， pH自然，溫度30 ℃，在一定氧分壓及通氣量下，當攪拌轉速增加到某一數值后，再增加攪拌轉速溶解氧濃度不再發生變化下的DO值標定為100%。文中測定的DO為相對值。

1.3.5 數據處理

每個實驗共設3個平行實驗，圖中的數據為3個獨立實驗的平均值。圖表生成采用Origin 7.5軟件進行數據分析，顯著性分析采用SPSS軟件進行數據分析，P≤0.01。

2 結果與討論

2.1 攪拌轉速對巴氏醋桿菌醋酸發酵的影響

在恒定通氣量的條件下，增大攪拌轉速可以提高KLa，強化供氧，是發酵過程中提高溶氧的重要手段[17，18]。

圖1 接種前不同攪拌轉速條件下的溶氧變化曲線

由圖1可知，DO電極校正后、接種前，通氣量0.7 vvm條件下，提高攪拌轉速能提高氧氣的溶解，提高發酵液的溶氧濃度。醋酸發酵過程中不同攪拌轉速條件下的溶氧變化曲線見圖2。不同攪拌轉速對巴氏醋桿菌菌體生長、產酸、單位菌體產酸的影響見圖3。

圖2 醋酸發酵過程中不同攪拌轉速條件下的溶氧變化曲線

圖3 攪拌轉速對巴氏醋桿菌菌體生長(a)、產酸(b)和單位菌體產酸(c)的影響

由圖2和圖3可知，在醋酸發酵中前期菌體快速生長，發酵液溶氧濃度快速下降；發酵16 h時，溶氧濃度下降到3%左右，菌體進入產酸高峰期，低溶氧水平維持一段時間；發酵28 h后，攪拌轉速700 r/min和600 r/min時菌體生長和產酸進入尾聲，耗氧量迅速下降，發酵液溶氧濃度快速上升。攪拌轉速500 r/min時，由于供氧不足醋酸發酵周期延長，發酵28 h后溶氧水平仍維持較低水平。結果表明：巴氏醋桿菌菌體生長和醋化乙醇過程中需要消耗大量的溶氧，尤其在16～28 h產酸高峰期對溶氧的需求更大，因此提高攪拌轉速增加供氧，能顯著促進菌體生長、產酸和單位菌體產酸。發酵28 h時，700 r/min時的巴氏醋桿菌菌體濃度比500 r/min時的菌體濃度提高了37%，菌體產酸提高了150%，單位菌體產酸提高了84%。推測原因是在醋酸發酵過程中增加供氧可能促進葡萄糖氧化和TCA循環偶聯呼吸鏈途徑產能，尤其是乙醇氧化和乙醇呼吸鏈途徑產能，為巴氏醋桿菌菌體生長和產酸提供更多的能量。

2.2 攪拌轉速對巴氏醋桿菌胞內ATP濃度及產能途徑關鍵酶活性的影響

提高攪拌轉速強化供氧對巴氏醋桿菌胞內ATP濃度的影響見圖4。

圖4 攪拌轉速對巴氏醋桿菌胞內ATP濃度的影響

由圖4可知，與攪拌轉速500 r/min時相比，600，和700 r/min時胞內ATP濃度分別提高了91%和302%。結果表明：提高轉速強化供氧能顯著提高巴氏醋桿菌菌體產能，尤其在發酵16～28 h的產酸高峰期影響更顯著。推測其原因是在發酵過程中強化供氧能促進菌體TCA循環偶聯呼吸鏈產能和乙醇氧化偶聯呼吸鏈產能。尤其是在發酵16～28 h的產酸高峰期，更多的乙醇氧化脫氫，電子通過乙醇呼吸鏈，經輔酶PQQ、血紅素c，進而經輔酶Q把電子傳遞到末端氧化酶，最終傳遞給電子受體氧，產生大量的能量ATP[19-21]，見圖5。

進一步分析菌體乙醇氧化偶聯呼吸鏈產能途徑關鍵酶活性(見圖6)發現，發酵16 h時，與攪拌轉速500 r/min時相比，700 r/min時胞內ADH，ALDH和ATPase 酶活性分別提高了40%，60%和56%。實驗結果表明：提高轉速強化供氧可顯著提高巴氏醋桿菌乙醇氧化偶聯呼吸鏈產能途徑關鍵酶的活性，強化乙醇氧化產酸和乙醇呼吸鏈途徑產能，為巴氏醋桿菌菌體生長和產酸提供更多的能量，滿足菌體快速生長和適應高酸生存環境對能量的需求，提高菌體對醋酸的耐受性[22]，從而提高菌體濃度和產酸速率，有助于通過調控能量代謝來指導醋酸發酵工藝優化與調控。

圖6 攪拌轉速對巴氏醋桿菌乙醇呼吸鏈產能途徑關鍵酶活性的影響

3 結論

本文通過提高攪拌轉速，探討強化供氧對巴氏醋桿菌醋酸發酵影響的機理。研究結果顯示：巴氏醋桿菌菌體生長和醋化乙醇過程中需要消耗大量的溶氧，尤其在16～28 h產酸高峰期對溶氧的消耗更大。攪拌轉速從500 r/min增加到 700 r/min后，胞內ATP濃度提高了302%；乙醇氧化偶聯呼吸鏈產能途徑關鍵酶ADH，ALDH和ATPase 酶活性分別提高了40%，60%和56%。提高攪拌轉速強化供氧可顯著提高巴氏醋桿菌乙醇氧化偶聯呼吸鏈產能途徑關鍵酶的活性，強化乙醇氧化產酸和乙醇呼吸鏈途徑產能，為巴氏醋桿菌菌體生長和產酸提供更多的能量，滿足菌體快速生長和適應高酸生存環境對能量的需求，提高菌體對醋酸的耐受性，從而提高菌體濃度和產酸速率。發酵28 h時，700 r/min時的菌體濃度比轉速為500 r/min時提高了37%，菌體產酸提高了150%，單位菌體產酸提高了84%。通過控制氧氣的供應控制胞內ATP濃度，為醋酸發酵代謝調控提供一個新的手段。

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Effects of Strengthening Oxygen Supply on Acetic Acid Fermentation and ATP Concentration ofAcetobacterpasteurianus

YIN Hai-song1,2, ZHANG Ren-kuan1, BAI Xiao-lei1, ZHENG Yu1, WANG Min1*

(1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457，China；2.School of Bioengineering，Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China)

The effects of dissolved oxygen on acetic acid fermentation ofAcetobacterpasteurianusis significant. But the mechanism of effects of dissolved oxygen on acetic acid fermentation is not very clear.By improving the agitation speed, the mechanism of effects of strengthening oxygen supply on acetic acid fermentation ofAcetobacterpasteurianusis researched in this paper. The experimental results show that the intracellular ATP concentration is increased by 302% and the enzyme activities of ADH,ALDH and ATPase in alcohol respiratory chain energy metabolism are increased by 40%,60% and 56% respectively when the agitation speed increases from 500 r/min to 700 r/min.Moreover,compared with the agitation speed of 500 r/min to 700 r/min, the bacteria concentration, acetic acid concentration and acetic acid production of unit cell are increased by 37%, 150% and 84% respectively when fermentation time is 28 h.From this we can know that large amount of dissolved oxygen is consumed in the process of bacterial growth and acetic acid production ofAcetobacterpasteurianus, especially when the acetic acid production reaches the maximum in 16～28 h.When strengthening the oxygen supply by increasing the agitation speed, the enzyme activities of key enzymes in alcohol respiratory chain energy metabolism ofAcetobacterpasteurianusare significantly improved. Also the acid production of ethanol oxidation and the energy production by alcohol respiratory chain are strengthened. Therefore, it can provide more energy for bacterial growth and acetic acid production ofAcetobacterpasteurianus,it also meets the energy needs for the rapid growth of bacteria and adapts to the high acetic acid living environment, and it improves the tolerance of bacteria to acetic acid.So the bacteria concentration and acetic acid production rate are increased.

Acetobacterpasteurianus; oxygen supply; agitation speed; acetic acid; ATP concentration

2017-01-03 *通訊作者

國家高技術研究發展計劃(863計劃)課題(2013AA102106)；國家自然科學基金資助項目(31201406)；天津市應用基礎及前沿技術研究計劃項目(13JCQNJC10000)

殷海松(1980-)，男，河北任丘人，副教授，博士，研究方向：食品發酵技術； 王敏(1971-)，女，教授，博士生導師，研究方向：食品發酵微生物功能分析與發酵技術等。

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.002

1000-9973(2017)06-0005-05