羧胺三唑聯(lián)合地塞米松有效緩解小鼠過敏性氣道炎癥

孫芳蕊，陳晨，石婧，鞠瑞，朱蕾，李娟，葉菜英，郭磊

羧胺三唑聯(lián)合地塞米松有效緩解小鼠過敏性氣道炎癥

孫芳蕊，陳晨，石婧，鞠瑞，朱蕾，李娟，葉菜英，郭磊

目的評價羧胺三唑（CAI）聯(lián)合地塞米松對小鼠過敏性氣道炎癥的治療效果，為哮喘性疾病探索安全、有效的聯(lián)合用藥方案。

方法將小鼠分為對照組、模型組、40 mg/kg CAI 治療組（CAI40）、低劑量地塞米松治療組（DL）、高劑量地塞米松治療組（DH）、低劑量地塞米松聯(lián)合 20 mg/kg CAI 治療組（DL20）、低劑量地塞米松聯(lián)合 40 mg/kg CAI 治療組（DL40）。建立過敏性哮喘模型，取肺泡灌洗液（BALF），ELISA 法檢測其中 IL-4、IL-13、IFN-γ 水平；計 BALF 中總細胞數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)；ELISA 法檢測血清中 IgE 水平；取左肺切片，HE 染色后觀察肺組織病理水平改變。

結果與對照組相比，模型組小鼠呈現(xiàn)出明顯的氣道炎癥反應，包括 BALF 中 IL-4、IL-13 水平及炎性細胞數(shù)明顯升高，而 IFN-γ 水平顯著降低，血清中 IgE 水平顯著升高，肺組織病理切片的 HE 染色結果呈現(xiàn)出明顯的炎癥細胞聚集浸潤。與模型組相比，各治療組均有緩解炎癥的效果。聯(lián)合用藥組小鼠的 BALF 中 IL-4、IL-13 水平及炎性細胞數(shù)均低于 CAI40 組和 DL 組，而 IFN-γ 水平高于三個單藥治療組。聯(lián)合用藥組血清中 IgE 水平均低于三個單藥治療組。肺組織病理結果顯示，聯(lián)合用藥組的肺組織炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生、氣道平滑肌增厚等氣道重塑程度均低于CAI40 組和 DL 組，與 DH 組相當。

結論低劑量地塞米松聯(lián)合低、高劑量羧胺三唑?qū)β亚宓鞍渍T導的小鼠過敏性氣道炎癥有良好的治療效果，比單藥治療組表現(xiàn)出更強的抗炎作用。因此，適當降低地塞米松劑量，通過聯(lián)合羧胺三唑來治療過敏性氣道炎癥，減少地塞米松耐藥性和依賴性等不良反應，或可成為治療過敏性氣道炎的一種新方法。

羧胺三唑； 地塞米松； 哮喘； 氣道炎癥

哮喘是一種慢性氣道炎癥，涉及多種炎性細胞和炎癥介質(zhì)。近年來隨著環(huán)境污染加重，哮喘的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢。糖皮質(zhì)激素是目前治療該疾病的最有效藥物，但少數(shù)患者對糖皮質(zhì)激素存在抵抗，治療效果不理想，且長時間使用糖皮質(zhì)激素還會產(chǎn)生一定的耐藥性及藥物依賴性。因此，我們亟需尋找有效的替代方法來預防和治療這種慢性氣道炎性疾病[1-2]。

羧胺三唑（carboxyamidotriazole，CAI）是一種非細胞毒類抗腫瘤藥物，近年來發(fā)現(xiàn) CAI 通過非選擇性抑制各亞型 PDEs，抑制 IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性細胞因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用。因此，考慮將 CAI 與地塞米松聯(lián)合應用，評價藥物對炎癥的治療作用，同時緩解地塞米松的耐藥性及依賴性[3-4]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 56 只 SPF 級 C57BL/6 雌性小鼠，6 ～ 8 周，體重 18 ～ 22 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗前一周適應性飼養(yǎng)于動物房，自由飲水攝食，環(huán)境溫度 25 ℃，濕度 40%～ 60%，每日 12 h 光照。

1.1.2 實驗分組 動物隨機分為 7 組，每組8 只，分別為對照組（CON）、模型組（PEG）、40 mg/kg CAI 治療組（CAI40）、低劑量地塞米松（0.25 mg/kg）治療組（DL）、高劑量地塞米松（0.5 mg/kg）治療組（DH）、低劑量地塞米松（0.25 mg/kg）聯(lián)合 20 mg/kg CAI 治療組（DL20）、低劑量地塞米松（0.25 mg/kg）聯(lián)合 40 mg/kg CAI治療組（DL40）。

1.1.3 藥物及試劑 羧胺三唑由中國醫(yī)學科學院藥物研究所合成。地塞米松磷酸鈉注射液購自北京協(xié)和醫(yī)院，產(chǎn)自廣州白云山天心制藥股份有限公司，規(guī)格：1 ml∶5 mg。卵清蛋白（OVA，grade V）購自美國 Sigma-Aldrich 公司；鋁佐劑（2%）購自美國 InvivoGen 公司；IL-4、IL-13、IFN-γ ELISA 試劑盒和 IgE ELISA 試劑盒購自達科為生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型建立及藥物治療 除對照組小鼠外，每組小鼠第 0、14 天腹腔注射 20 μg OVA 和200 μl 免疫佐劑致敏，對照組小鼠腹腔注射 200 μl生理鹽水。第 21 ～ 26 天除對照組，每組小鼠霧化吸入 5% OVA 激發(fā)，對照組小鼠霧化吸入生理鹽水，每天持續(xù)激發(fā) 1 h[5-7]。激發(fā)前 0.5 h，模型組小鼠灌胃 PEG400（CAI 溶劑），給藥組小鼠根據(jù)對應組別給藥。對照組小鼠激發(fā)前 0.5 h 腹腔注射200 μl 生理鹽水（圖 1）。

1.2.2 BALF 中 IL-4、IL-13、IFN-γ 檢測及細胞計數(shù) 末次激發(fā) 24 h 后小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，暴露氣管，注射器取 0.5 ml PBS 灌洗肺泡，反復 3 次，共得 1.5 ml 肺泡灌洗液（BALF）。BALF 于 4 ℃、2500 r/min 離心 10 min，收集上清，用于檢測 IL-4、IL-13、IFN-γ 含量，具體步驟根據(jù) ELISA 試劑盒說明書進行。BALF 沉淀用1 ml PBS 重懸，計總細胞數(shù)。取 200 μl 細胞懸液涂片，晾干固定后，瑞氏-吉姆薩染色，顯微鏡下做細胞分類，計 200 個細胞中嗜酸性粒細胞個數(shù)。

1.2.3 血清中總 IgE 檢測 末次激發(fā) 24 h 后小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，開胸腔暴露心肺，心臟取血，血液于 4 ℃、3000 r/min 離心 25 min，收集血清。血清用于檢測 IgE 含量，具體步驟根據(jù)ELISA 試劑盒說明書進行。

1.2.4 肺組織病理切片及染色 末次激發(fā) 24 h后小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，開胸腔暴露心肺，取肺組織浸泡于 4% 多聚甲醛中固定。常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察炎癥細胞浸潤和氣道重塑情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用 SPSS19.0 軟件分析，GraphPad Prism5 作圖，數(shù)據(jù)用表示，組間比較使用單因素方差分析，P ＜ 0.05 時表示差異有統(tǒng)計學意義。

圖 1 OVA 誘導小鼠過敏性哮喘模型建立Figure 1 The mice model of asthma induced by ovalbumin

2 結果

2.1 BALF 中 IL-4、IL-13、IFN-γ 水平

與對照組相比，模型組小鼠 IL-4、IL-13 顯著增加（P ＜ 0.001）、IFN-γ 水平顯著降低（P ＜ 0.001）；與模型組小鼠相比，DL 組及 DH 組的 IL-4 水平明顯下調(diào)（P ＜ 0.01），CAI40 組的 IL-4 水平有所下調(diào)（P ＜ 0.05），DL20 組小鼠的 IL-4 水平顯著下調(diào)（P ＜ 0.001），且比單獨使用高劑量地塞米松組小鼠的 IL-4 水平下調(diào)明顯，效果好于 DL40 組；DL40 組小鼠的 IL-4 水平明顯下調(diào)（P ＜ 0.01），比 CAI40 組小鼠和 DL 組小鼠下調(diào)顯著，與高劑量地塞米松組作用相當（圖 2A）。BALF 中 IL-13水平各治療組均比模型組明顯下調(diào)（P ＜ 0.001），且聯(lián)合用藥組的下調(diào)作用強于 CAI40 組和 DL 組（圖 2B）。BALF 中 IFN-γ 水平在 CAI40 組和DL40 組均明顯上升（P ＜ 0.01），DH 組和 DL20組小鼠 BALF 中 IFN-γ 水平均有所上升（P ＜0.05），而 DL 組小鼠 BALF 中 IFN-γ 水平無明顯變化（P ＞ 0.05），聯(lián)合用藥組小鼠 BALF 中IFN-γ 水平均比單獨使用地塞米松上調(diào)效果明顯，且 DL40 組作用效果最佳（圖 2C）。各治療組均能有效緩解 Th2 細胞與 Th1 細胞的功能失衡，且DL20 組的緩解效果強于 CAI40 組、DL 組及 DH組（圖 2D）。

2.2 BALF 中細胞種類分析

與對照組相比，模型組小鼠的總細胞數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)均明顯增加（P ＜ 0.001）。與模型組相比，各治療組 BALF 中細胞總數(shù)均明顯下降（P ＜0.001），兩個聯(lián)合用藥組降低 BALF 中細胞總數(shù)的作用均比單獨使用 CAI40 組和 DL 組明顯，與DH 組水平相當（圖 3A）。各治療組小鼠 BALF 中的嗜酸性粒細胞數(shù)均顯著下降（P ＜ 0.001），而DL20 組和 DL40 組嗜酸性粒細胞降低水平均比CAI40 組和 DL 組明顯，且 DL40 組效果優(yōu)于DH 單藥治療組（圖 3A）。

2.3 血清中 IgE 水平

與對照組相比，模型組小鼠血清中 IgE 水平明顯增加（P ＜ 0.001）；CAI40 組、DL 組、DH 組小鼠血清中 IgE 水平較模型組小鼠明顯下調(diào)（P ＜0.05）；DL20 組小鼠血清中 IgE 水平較模型組小鼠顯著下調(diào)（P ＜ 0.01），DL40 組小鼠血清中 IgE水平較模型組小鼠顯著下調(diào)（P ＜ 0.001），兩聯(lián)合用藥組小鼠血清中 IgE 水平均低于 CAI40 組、DL組及 DH 組，其中 DL40 組小鼠血清中 IgE 水平下調(diào)最為明顯（圖 4）。

圖 2 ELISA 檢測各組小鼠肺泡灌洗液中 IL-4（A）、IL-13（B）、INF-γ 含量（C）以及 Th2 細胞與 Th1 細胞（IL-4 與 INF-γ）功能失衡比（D）（#與對照組比較，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001；*與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）Figure 2 The levels of IL-4 (A)、IL-13 (B)、INF-γ (C) and the unbalance of Th2 cytokines and Th1 cytokines (D) (#P ＜ 0.01,###P ＜0.001 compared with control group;*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001 compared with model group)

圖 3 各組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)（A）和嗜酸性粒細胞數(shù)（B）（#與對照組比較，###P ＜ 0.001；*與模型組比較，***P ＜ 0.001）Figure 3 The count of total inflammatory cell (A) and eosinophils (B) in BALF (###P ＜ 0.001 compared with control group;***P ＜0.001 compared with model group)

2.4 肺組織病理形態(tài)觀察

在 100 倍光學顯微鏡下可看到，正常組小鼠支氣管周圍無明顯炎性細胞浸潤，氣道結構及管壁正常；模型組小鼠的支氣管壁上皮明顯增厚、脫落，支氣管平滑肌增厚，杯狀細胞增生明顯，氣道周圍可見大量嗜酸性粒細胞及巨噬細胞聚集浸潤；各給藥組小鼠的炎癥程度均有所緩解，兩個聯(lián)合用藥組小鼠抑制炎癥細胞浸潤的作用強于 DL 組和CAI40 組，DL40 組抑制炎癥細胞浸潤程度效果與DH 組相當。兩個聯(lián)合用藥組小鼠均未見明顯的氣道上皮及平滑肌增厚，亦未見明顯杯狀細胞增生，對氣道重塑的抑制作用均強于 DL 組、DH 組及CAI40 組（圖 5）。

圖 4 ELISA 檢測各組小鼠血清中 IgE 含量（#與對照組比較，###P ＜ 0.001；*與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P＜ 0.001）Figure 4 The level of IgE in serum measured by ELISA (###P＜ 0.001 compared with control group;*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001 compared with model group)

圖 5 HE 染色觀察各組小鼠肺組織病理切片中炎癥細胞浸潤程度（× 100）Figure 5 The recruitment of infiltrated inflammatory cell in lung tissue stained with HE (× 100)

3 討論

過敏性哮喘是由 IgE 介導的 I 型超敏反應，過敏源進入人體后，激活 Th2 細胞和 B 細胞，誘導產(chǎn)生特異性 IgE，使機體處于致敏狀態(tài)。當機體患病嚴重時，體內(nèi) IgE 水平明顯升高。因此降低IgE 水平成為評價過敏性哮喘治療效果的重要指標。在哮喘的發(fā)病機制中，Th2 細胞的異常活化起到至關重要的作用[8]，Th2 細胞主要分泌 IL-4、IL-13、IL-5 等細胞因子，與體內(nèi) IgE 分泌增加、嗜酸性粒細胞大量分化聚集有關[9-10]；Th1 細胞在哮喘疾病中主要表現(xiàn)為抑制效果，主要分泌細胞因子 IFN-γ，故 Th1 細胞與 Th2 細胞的異常失衡是衡量哮喘疾病嚴重程度的重要指標[11]。哮喘的主要表現(xiàn)為肺組織內(nèi)大量炎癥細胞聚集，氣道重塑，炎癥細胞因子分泌增加，IgE 含量升高等[9]。

糖皮質(zhì)激素類藥物是一種經(jīng)典的治療哮喘的藥物，吸入糖皮質(zhì)激素類藥物可以有效地抑制哮喘氣道炎性程度，但此類藥物有嚴重的不良反應，長期使用會導致機體產(chǎn)生耐藥性、依賴性，甚至會導致老人和兒童骨質(zhì)疏松等。尋找有效、安全的替代藥物已成為近幾年治療哮喘疾病領域的熱點。

羧胺三唑是一種非細胞毒類的藥物，早期用于抑制腫瘤細胞增殖，近期有實驗表明其在抗炎方面表現(xiàn)出良好的效果[4]。同時也已證實 CAI 是非選擇性的 PDE 抑制劑[3]，對各種不同亞型 PDEs 均有抑制作用。此外，羧胺三唑的不良反應少且輕微，主要表現(xiàn)為胃腸道反應，藥物安全性較好。因此考慮將 CAI 與糖皮質(zhì)激素類藥物地塞米松合用，在達到治療效果的同時，減少地塞米松用量，減輕其耐藥性等不良反應。

本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)將低劑量地塞米松分別與 20 和 40 mg/kg CAI 合用，均表現(xiàn)出顯著的抗炎效果，作用強于 DL 組和 CAI40 組。在緩解Th2 型細胞異常活化方面，DL20 組抑制 IL-4、IL-13的作用與使用高劑量地塞米松組（DH 組）效果相當；在活化 Th1 細胞方面，DL40 組的作用優(yōu)于 DH 組；在調(diào)節(jié) Th2 細胞與 Th1 細胞功能失衡方面，DL20 組的效果最佳。在抑制肺泡炎癥細胞和嗜酸性粒細胞方面，DL40 組的抑制效果強于 DH 組。同時，DL20 組和 DL40 組均表現(xiàn)出良好的抑制 IgE 產(chǎn)生的效果，其作用均強于 DH組。通過肺組織病理切片中發(fā)現(xiàn)，DL20 組和 DL40組緩解肺部炎癥細胞浸潤、聚集，抑制氣道重塑的作用強于 DL 組和 CAI40 組，作用效果與 DH組相當。

綜上所述，本研究證實了將低劑量地塞米松分別與 20 和 40 mg/kg CAI 合用，不僅減少了糖皮質(zhì)激素類藥物的用量，又達到了與高劑量地塞米松相當?shù)淖饔眯ЧＴ谶_到抗炎效果的同時，有望克服長期大量使用糖皮質(zhì)激素類藥物所產(chǎn)生的耐藥性問題和其他嚴重不良反應，為有效地治療哮喘等慢性氣道炎性疾病提供新型的藥物組合。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(3):242-247

小牛血類產(chǎn)品原料質(zhì)量管理檢查手冊研討會在京召開

4 月 21 日，我會在京召開小牛血類產(chǎn)品原料質(zhì)量管理檢查手冊研討會，李少麗副理事長出席會議。《小牛血類產(chǎn)品原料質(zhì)量管理檢查手冊》起草小組向與會代表介紹規(guī)范起草的過程，在起草過程中參考了 GMP 和其他相關規(guī)定，與專家和業(yè)內(nèi)企業(yè)進行交流，形成了本次討論的草稿。

會上，中國食品藥品檢定研究院沈琦所長、董關木研究員、李秀華副研究員結合協(xié)會新生牛血清達標檢查工作和 GMP工作的經(jīng)驗，對小牛血類產(chǎn)品原料質(zhì)量管理檢查的主體、項目、程度提出了建議，并明確協(xié)會行業(yè)自律工作和 GMP 檢查的不同。會議逐條對檢查手冊的具體條款進行討論，參會代表就實際生產(chǎn)過程中的問題和專家進行交流，專家根據(jù) GMP 生化藥品附錄的規(guī)定對企業(yè)提出建議，強調(diào)小牛血類產(chǎn)品原料質(zhì)量管理檢查針對企業(yè)是否對原料采集單位進行了質(zhì)量延伸管理，并細化相關要求。經(jīng)過討論，與會代表一致認為修改后的達標檢查手冊的條款對企業(yè)具有指導意義。會議要求檢查手冊起草小組根據(jù)會議意見，修改手冊后并再征求意見。

食藥總局發(fā)布仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價品種分類指導意見為規(guī)范仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價工作，國家食品藥品監(jiān)督管理總局組織制定了《仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價品種分類指導意見》。詳情請登錄國家食品藥品監(jiān)督管理總局網(wǎng)站 http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0087/171385.html 查閱。

Inhibitory effects of combined carboxyamidotriazole with dexamethasone in allergic airway inflammation

SUN Fang-rui, CHEN Chen, SHI Jing, JU Rui, ZHU Lei, LI Juan, YE Cai-ying, GUO Lei

ObjectiveTo evaluate the inhibitory effects of combined carboxyamidotriazole (CAI) with dexamethasone (DEX) in allergic airway inflammation.

MethodsThe allergic asthma model was established by ovalbumin (OVA) sensitization and challenge in mice, which were divided into the following groups: control group (CON), model group (PEG), 40 mg/kg CAI-treated group (CAI40), low-dose DEX-treated group (DL), high-dose DEX-treated group (DH), the combination of 20 mg/kg CAI with low-dose DEX treated group (DL20), the combination of 40 mg/kg CAI with low-dose DEX treated group (DL40). The levels of IL-4, IL-13, IFN-γ in bronchoalveolar lavage (BALF) and the content of IgE in serum were measured by ELISA. Cell counting was conducted to quantify the total inflammatory cells number and eosinophils number in BALF. Lung tissues were cut into slices and stained with HE for evaluation of recruitment of infiltrated inflammatory cells.

ResultsThe model group presented severe airway inflammatory responses compared with control group. All treatment strategies effectively inhibited airway inflammatory responses. Lower levels of IL-4, IL-13 or IgE were observed in DL20 group compared with CAI40 group and DL group. In DL40 group, the IgE level in serum was significantly lower than that of DH group, and the total inflammatory cells number and eosinophils number in BALF of DL40 group were significantly less than that in DH group. Both combination groups showed milder recruitment of inflammatory cells in lung tissues compared with CAI40 group and DL group.

ConclusionThe airway inflammatory responses are effectively inhibited in all the treatment groups. Furthermore, better effects are seen in both combination groups than in 40 mg/kg CAI-treated group and low-dose DEX-treated group. This study may provide a new way to treat allergic airway inflammation by the combination of carboxyamidotriazole with dexamethasone, with the potential ofreducing adverse reactions of glucocorticoids.

Carboxyamidotriazole; Dexamethasone; Asthma; Allergic airway inflammation

GUO Lei, Email: guoleistu@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.009

國家自然科學基金（81402923）；北京協(xié)和醫(yī)學院 2015 協(xié)同創(chuàng)新基金（3332015168）；“十二五”國家科技重大專項（2014ZX 09507003-003）；2016重大協(xié)同創(chuàng)新項目（2016-I2M-1-011）

100005 北京，中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所

郭磊，Email：guoleistu@sina.com

2017-02-04

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術, 2017, 12(3):242-247

Author Affiliation: Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100005, China