殼聚糖流體敷料膜的制備及其促傷口愈合的研究

易喻，徐云霞，梅建鳳，陳建澍，張彥璐，應國清

殼聚糖流體敷料膜的制備及其促傷口愈合的研究

易喻，徐云霞，梅建鳳，陳建澍，張彥璐，應國清

目的探討殼聚糖流體敷料膜的透氣性、阻菌性、促傷口愈合等效果。

方法制備殼聚糖流體敷料膜，對其透氣、阻菌、皮膚刺激、細胞毒性等性能進行考察，建立家兔傷口模型，以創面愈合時間、創面愈合率為指標，評價其促傷口愈合能力。

結果殼聚糖流體敷料膜能在 9 min 內成膜，透氣率為（2431 ± 63）g/(m2·d)，具有阻菌性，良好的細胞相容性、無皮膚刺激性，在促傷口愈合方面，實驗組、陽性組和陰性組創面愈合時間分別為（12.88 ± 0.71）、（15.67 ± 0.41）、（17.17 ± 0.61）d（P ＜ 0.05）。與對照組相比，實驗組在傷后各時間點的創面愈合率明顯提高（P ＜ 0.05）。

結論殼聚糖流體敷料膜具有良好透氣性、阻菌性，無皮膚刺激性及具有促傷口愈合的能力，在醫用敷料領域具有一定應用價值。

殼聚糖； 流體敷料膜； 傷口愈合

殼聚糖是一種天然高分子材料，具有低毒性、生物相容性，抑菌活性及可生物降解等性質[1]。相關研究表明，殼聚糖及其衍生物還能夠促進皮膚成纖維細胞的生長[2]，加速傷口愈合過程，抑制瘢痕成纖維細胞的增殖[3]，防止疤痕形成。因此，殼聚糖及其衍生物被認為是醫用敷料的理想原料。殼聚糖流體敷料膜是以殼聚糖及其衍生物為主要原料，添加成膜材料、藥用輔料成分和易揮發的溶劑，研制得到的一種半流體敷料[4]。該敷料涂抹至傷口處，可形成一層柔軟、具黏附性的膜。流體敷料膜除可在某些皮膚病及各種外傷康復等的治療中發揮顯著作用，尤其適合人體腔道等難以包扎部位以及燒燙傷造成的特殊形狀傷口的治療[5]。近年來，國內外對這種流體敷料膜的關注不在少數，一種理想的敷料，應同時具備透氣性、保濕性、阻菌性及促傷口愈合等作用，流體敷料膜恰好具備這些條件。

本文利用 N-糖基化殼聚糖的促傷口愈合作用和聚乙烯醇良好的成膜性，添加其他藥用輔料，制備出一種新型殼聚糖流體敷料膜，并建立家兔傷口模型，對這種流體敷料膜的性能進行評價，為其實際應用奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 N-糖基化殼聚糖（DD = 67%）為實驗室自制；薄荷腦購自上海生物化工有限公司；聚乙烯醇購自國藥集團化學試劑有限公司；乳酸購自天津市東麗區天大化工試劑廠；雙氧水購自上海凌峰化學試劑有限公司；乙醇購自安徽安特食品股份有限公司。

1.1.2 實驗動物 家兔 6 只，體重 2.5 ～ 2.75 kg，雌雄各半，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。自由攝食飲水，室溫條件下飼養 1 周后進入實驗。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖流體敷料膜的制備 稱取適量 N-糖基化殼聚糖于燒杯中，加入定量生理鹽水和乳酸，攪拌至溶解得到 20 mg/ml 的殼聚糖溶液；稱取適量聚乙烯醇（PVA）加水溶脹后，在 95 ℃ 下加熱攪拌至完全溶解，得 10% PVA 膜液；將 N-糖基化殼聚糖溶液和 PVA 溶液按 1∶2 體積比混合，依次添加橄欖油 0.35 ml、薄荷腦 0.1 g、雙氧水 0.9 ml和乙醇 8 ml，攪拌 15 min 混合均勻，即得殼聚糖流體敷料膜。

為進一步研究殼聚糖流體敷料的理化性能，采用流延法鋪膜，將適量流體均勻涂布于載玻片上，37 ℃ 干燥制得流體敷料膜。

1.2.2 成膜時間測定 精密移取 0.1 ml 流體敷料，均勻涂抹于人體手背，記下時間 t1，待流體敷料揮發成膜后記下時間為 t2,（t2– t1）即為皮膚成膜時間。

1.2.3 透氣性試驗 按照國家醫藥行業標準《接觸性創面敷料試驗方法第 2 部分：透氣膜敷料水蒸氣透過率》（YY/T 0471.2-2004）進行透氣性測試，具體步驟如下：將流體敷料膜（厚度約為 0.05 mm）固定在瓶口面積為 10 cm2的容器口，確保完全封閉，容器內放滿水，稱量并記錄容器、水、敷料膜的總質量 W1，在恒溫為（37 ± 1）℃、相對濕度 ＜20% 的空間里放置 24 h 后，再稱量記錄質量 W2，通過下式計算水蒸氣透過率（WVTR）：

WVTR =（W1– W2）× 1000 × 24/t；t 為測定時間；WVTR 的單位為 g/(m2·d)。

1.2.4 阻菌性試驗 按照國家醫藥行業標準《接觸性創面敷料試驗方法第 5 部分：阻菌性》（YY/T 0471.5-2004），對流體敷料膜的阻菌性能進行測試。具體步驟如下：將一個圓形流體敷料膜（r = 1 cm）移至裝有無菌營養瓊脂培養基的培養皿上，用滴管吸取一滴黏質沙雷菌（CGCC LL-413）的混懸液接種于敷料膜中央，20 ～ 25 ℃ 下培養 24 h。培養結束后取下敷料膜，繼續于 20 ～ 25 ℃ 下培養 24 h，最終觀察被樣品覆蓋的表面積內是否有黏質沙雷菌紅色菌落生長。同理，以相同大小的醫用紗布作為對照組，重復上面操作，觀察是否有黏質沙雷菌生長。整個操作過程為無菌操作。

1.2.5 皮膚刺激性試驗 根據文獻[6]的方法，取家兔 2 只，雌雄各半，試驗前 24 h 背部脊柱兩側脫毛，左、右各 3 cm × 3 cm，取流體敷料直接涂抹于一側，另一側不作處理，作為自身對照。持續24 h 后除去藥物，以肉眼觀察用藥皮膚局部有無紅斑及水腫等情況為評價指標，進行皮膚刺激性評分。無紅斑為 0 分，輕度（勉強可見）、中度（明顯可見）、重度紅斑及紫紅色紅斑并伴有焦痂形成依次評價為 1、2、3、4 分；輕度、中度、重度（皮膚隆起 1 mm，輪廓清楚）和嚴重性水腫（皮膚隆起 1 mm 以上并有擴大）評價為 1 ～ 4 分。將這兩項的評分綜合起來，位于 0 ～ 0.49 為無刺激性，0.5～ 2.99 為輕度刺激性，3.0 ～ 5.99 為中度刺激性，6.0 ～ 8.0 為強刺激性。

1.2.6 細胞毒性試驗[7]取流體敷料膜樣品，以0.1 g/ml 比例用 DMEM 細胞培養基于 37 ℃ 下浸提 24 h，制得浸提液；取培養至對數期的 L929細胞種于 96 孔板，每孔接種 100 μl 細胞濃度為5 × 104個/ml 的細胞液，于 37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內培養 24 h，然后將 96 孔板中的培養液吸去，加入 100 μl 制備好的浸提液，對照組加入100 μl DMEM 培養基，每組設置 5 組平行，于37 ℃、5% CO2的培養箱內分別培養 24、48 h。培養到相應時間后，在 96 孔板中加入 20 μl 濃度為 5 mg/ml 的 MTT 溶液，繼續培養 4 h 后，吸凈孔內液體，加入 100 μl 二甲基亞砜，于培養箱中振蕩 10 min 后，在 490 nm 波長下測定吸光值（OD），計算細胞相對增殖率（%）= OD實驗組/ OD對照組× 100%。

1.2.7 建立全層皮膚切除傷模型[8]取家兔 6 只，雌雄各半，稱重后取俯臥位，剪去其背部局部毛發，用硫化鈉脫毛，10% 水合氯醛麻醉（3 ml/kg），用碘伏及乙醇常規消毒皮膚后，于兔子距脊柱兩側割長 1.5 cm，寬 1.0 cm 的傷口 4 個，傷口的厚度為0.15 cm，造成一個全層皮膚切除開放創面。對 4 個傷口進行編號，分別為 1 ～ 4號，1 號予以不添加殼聚糖的流體敷料膜 0.1 ml（陰性對照組），2 號予以日本小林液體創可貼 0.1 ml（陽性對照組），3、4 號予以殼聚糖流體敷料膜 0.1 ml（實驗組），敷藥時涂抹均勻至完全覆蓋創口，處理后的創口用無菌紗布包扎好，每 12 小時更換一次。

1.2.8 創面觀察[9-10]給藥記作第一天，每天觀察創面形態和有無滲出液情況，創面收縮的面積大小，創面周圍肉芽組織和上皮組織的生長情況，創面愈合時間。創面面積測量：傷后第 3、7、10 和15 天，用計算機圖像分析軟件計算創面面積。創面愈合率（%）=（原始創面面積 – 未愈合創面面積）/原始創面面積 × 100%。

1.3 統計學處理

以上所有數據均用 SPSS 18.0 軟件進行分析，以 P ＜ 0.05 為有統計學意義，數據以表示。

2 結果

2.1 殼聚糖流體敷料膜的性能參數

2.1.1 性狀和氣味 使用前為乳白色的半流動性液體，質地均勻，帶有薄荷腦清香味。使用后呈形態光滑平整且透明的膜，見圖 1。

2.1.2 pH pH 值為 5.5，而引起創面感染的大多數病原菌生長增殖的適宜 pH 值為 7.2 ～ 7.4。

2.1.3 成膜時間 涂于皮膚表面 9 min 內成膜，說明此殼聚糖流體敷料膜具有良好的可塑性。

2.2 透氣性

WVTR 是評價創傷敷料的一個重要指標，正常皮膚的透氣性是 204 g/(m2·d)，受傷皮膚是 279 ～5138 g/(m2·d)[11]，優良的醫用敷料的透氣率理想值應高于 1000 g/(m2·d)[12]，該敷料透氣率為（2431 ± 63）g/(m2·d)。因此，該殼聚糖流體敷料膜的透氣性良好。

2.3 阻菌性

在阻菌性試驗中，可觀察到對照組（紗布）有黏質沙雷菌的生長（圖 2A），而實驗組（流體敷料膜）沒有產生黏質沙雷菌（圖 2B），說明紗布不能起到阻擋黏質沙雷菌的作用，在包扎傷口過程中容易使傷口受到外界細菌的感染，而流體敷料膜具有良好的阻菌性，能夠阻擋外界細菌對創面的污染。

圖 1 殼聚糖流體敷料膜的形態Figure 1 The morphology of chitosan fluid dressing membrane

圖 2 殼聚糖流體敷料膜的阻菌性結果（A：對照組；B：實驗組）Figure 2 The result of bacterial resistance for the chitosan fluid dressing membrane (A: Control group; B: Experimental group)

表 1 細胞相對增殖率與細胞毒性分級的關系Table 1 The relative cell growth rate and cell toxicity

表 2 流體敷料膜的細胞增殖率與毒性評價（P ＜ 0.05）Table 2 The relative cell growth rate and cell toxicity of fluid dressing membrane (P ＜ 0.05)

2.4 皮膚刺激性

家兔裸露皮膚涂抹了殼聚糖流體敷料膜后，未出現紅斑、水腫等過敏現象，皮膚狀況和對照組皮膚基本一致，故皮膚刺激反應評分為 0，因此可見殼聚糖流體敷料膜對家兔皮膚無刺激性。

2.5 細胞毒性

細胞毒性評價標準見表 1，本實驗采用 MTT法測定的細胞毒性，結果見表 2。

在 24 h 和 48 h 時，實驗組的細胞增殖率分別為 91.44% 和 95.56%，說明該流體敷料膜的細胞毒性僅為 1 級，符合生物醫用材料的細胞毒性要求。

2.6 創面愈合觀察

造模的家兔麻醉清醒后，精神沉郁，活動少，少食少水。第 2 天家兔精神狀態良好，活動逐漸恢復正常，傷口處濕潤，無出血紅腫情況。第 3 天各組傷口均開始結痂，兩組對照的創面較實驗組不平整，實驗組肉芽組織生長明顯。給藥第 7 天，對照組和實驗組創面均有不同程度縮小，實驗組創面縮小較明顯，同時，實驗組和陽性組傷口痂皮脫落，有大量肉芽組織增生以修補傷口。第 10 天，陰性組的痂皮自然脫落，實驗組的新上皮組織分布均勻，基本愈合；陽性組創面中央仍有血痂。第15 天時，實驗組創面全部愈合，陽性組基本愈合，陰性組仍有 1/10 創面未收口（圖 3）。

各組創面全部愈合后形成的疤痕也有較大差別：陰性組形成疤痕凸出皮膚明顯，用手觸摸可感受到硬結塊；陽性組形成明顯疤痕，原創面中間皮膚略凹凸不平整；實驗組形成疤痕凸出皮膚不明顯，用手觸摸無硬結，恢復情況良好。說明殼聚糖流體敷料膜還可以抑制傷口組織疤痕的異常增生，具有抑制癱痕形成的作用。

2.7 創面愈合情況結果

實驗組、陽性組和陰性組創面愈合時間分別為（12.88 ± 0.71）、（15.67 ± 0.41）、（17.17 ± 0.61）d，和陰性組相比，實驗組和陽性組傷口愈合時間均提前，實驗組的愈合時間明顯縮短，差異均有統計學意義（P = 0.018，P = 0.025）。通過計算機圖像分析軟件得到創面面積，進一步計算得出創面愈合率，結果如表 3 所示。

圖 3 肉眼觀察家兔皮膚創面愈合Figure 3 Macroscopic observation of rabbit skin wound healing process

表 3 陰性組、陽性組與實驗組創面愈合率比較（±s，%，n = 6）Table 3 Comparison of the wound healing rate among the negative group, the positive group and the experimental group (±s, %, n = 6)

表 3 陰性組、陽性組與實驗組創面愈合率比較（±s，%，n = 6）Table 3 Comparison of the wound healing rate among the negative group, the positive group and the experimental group (±s, %, n = 6)

注：與陰性對照組比較，*P ＜ 0.05。Note: Compared with negative group,*P ＜ 0.05.

組別 Group 3 d 7 d 10 d 15 d陰性組 Negative group 20.41 ± 1.76 32.91 ± 2.79 46.67 ± 3.67 76.67 ± 4.26陽性組 Positive group 17.33 ± 2.05* 40.50 ± 3.44* 70.32 ± 1.96* 93.33 ± 3.85*實驗組 Experimental group 21.67 ± 1.92* 63.67 ± 3.12* 86.67 ± 4.24 100*

3 討論

殼聚糖流體敷料能緊密覆蓋皮膚創面形成一層透明薄膜，可方便觀察創面情況，是一類非常理想的新型醫用材料[13-14]。同時，這類流體敷料與 1962 年 George Winter 提出的“濕性愈合”理論[15]也相符。本實驗采用 N-糖基化殼聚糖和聚乙烯醇為主要原料，添加其他輔料成分，制備得到一種新型的殼聚糖流體敷料膜。聚乙烯醇的添加增強了該敷料的成膜性能，且聚乙烯醇具有良好的生物相容性和可生物降解性；橄欖油對傷口具有保濕作用，能減輕傷口疼痛，促進愈合，愈后不留疤痕，美國、德國等西方國家早已把橄欖油載入藥典；薄荷腦具有清涼感，添加在敷料中可消炎鎮痛止癢；雙氧水常用于醫用消毒殺菌，又可作為致孔劑，雙氧水歧化釋放氧氣而使薄膜致孔透氣，此外歧化反應放熱能加速成膜；乙醇在此主要作為揮發性溶劑，使流體敷料快速成膜。該敷料膜無肝首過作用，毒副作用較小，涂抹覆蓋創面，可以有效保護創面組織。該敷料的 pH 值為 5.5，給創面營造一個微酸的環境。微酸環境能抑制創面細菌的生長，同時促進成纖維細胞的合成以及刺激血管增生，有利于創面的愈合[16]。此外，實驗得到的敷料膜透氣率為（2431 ± 63）g/(m2·d)，相關研究指出[17]，當創傷敷料的透氣率在 2000 ～ 2500 g/(m2·d) 之間，既有優良的透氣性，又能維持創面的濕潤環境，起到防止創面過度脫水和滲出液過量累積的作用。因此本實驗制備的流體敷料膜，除具有良好的透氣性能外，還能夠有效阻止水分的蒸發，給創面提供一個濕潤環境，促進創面愈合。從阻菌性實驗看出，該流體敷料膜具有良好的阻菌性，能夠良好阻擋外界細菌對創面的污染。從動物實驗中可知，該流體敷料膜能夠加速創面的愈合，且抑制瘢痕形成。

綜上所述，本實驗制得的流體敷料膜具有良好的理化特性及促傷口愈合的能力。隨著醫用敷料的迅速發展，濕性敷料有望占據整個敷料市場中的優勢位置，因而這種新型的殼聚糖流體敷料膜具有廣闊的發展空間，有望進一步研究并應用于皮膚淺表創傷、皮膚潰瘍及燒燙傷等的修復護理。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(3):232-237

我會參加國家兩委局干細胞制劑和臨床研究質量管理培訓班

4 月 21 日，國家衛生計生委科教司會同食品藥品監管總局藥化注冊司在云南省昆明市共同舉辦了干細胞制劑和臨床研究質量管理培訓班。培訓班針對國內外干細胞臨床研究進展、如何開展規范的臨床研究、干細胞制劑質量控制及臨床前研究的要求、干細胞臨床研究質量受權人的職責及審計體系的建立、干細胞制劑質量標準的建立和質量復核、干細胞臨床研究項目備案材料準備等內容對 30 家已備案干細胞臨床研究機構的干細胞制劑質量受權人和項目負責人以及 16 個省（市）衛生計生委科教處和食品藥品監管局藥化注冊處干細胞臨床研究管理業務人員共計一百余人進行了培訓。我會吳朝暉秘書長應科教司邀請，在培訓班上就“干細胞臨床研究項目備案材料申報注意事項”進行了講解。

干細胞質量管理檢查手冊在京修訂

4 月 20 日，我會在京召開會議修訂干細胞質量管理檢查手冊，吳朝暉秘書長、協會標準工作專家委員會張愛萍委員出席會議。《干細胞質量管理檢查手冊》起草小組向與會代表介紹手冊起草的過程，在起草過程中數次改稿，多次與專家和業內企業進行交流，形成了本次討論的草稿。

會上，張愛萍結合自身 GMP 檢查的經驗，對《干細胞質量管理檢查手冊》的章節架構、制定原則提出了建議。隨后，會議逐條對檢查手冊的具體條款進行討論，參會代表就實際生產過程中的問題和專家進行交流，并對檢查條款的內容進行了修改，保證條款的科學性和適用性。經過討論，會議基本就《干細胞質量管理檢查手冊》的內容和修改達成一致。

Studies on preparation of chitosan fluid dressing membrane and its promoting wound healing

YI Yu, XU Yun-xia, MEI Jiang-feng, CHEN Jian-shu, ZHANG Yan-lu, YING Guo-qing

ObjectiveTo investigate the effect of chitosan fluid dressing membrane on the properties of permeability, antibacterial resistance and wound healing.

MethodsA chitosan fluid dressing membrane was prepared and its permeability, antibacterial property, cell toxicity and skin irritation were observed. Then the rabbit wound model was established, the wound healing time was observed, and wound healing rate as indicators was used to evaluate its ability to promote wound healing.

ResultsChitosan fluid dressing formed a membrane in 9 min, and its permeability was (2431 ± 63) g/(m2·d). Fluid dressingmembrane showed antibacterial, good cell compatibility without skin irritation, and the wound healing time was (12.88 ± 0.71) d, (15.67 ± 0.41) d, and (17.17 ± 0.61) d (P ＜ 0.05) in the experimental group, the positive group, and the negative group, respectively. The wound healing rate in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P ＜ 0.05).

ConclusionChitosan fluid dressing membrane possesses good permeability, antibacterial, no skin irritation, and has the ability to promote the wound healing. it could have a certain application value in the field of medical dressings.

Chitosan; Fluid dressing membrane; Wound healing

YING Guo-qing, Email: gqying@zjut.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.007

310014 杭州，浙江工業大學藥學院

應國清，Email：gqying@zjut.edu.cn

2017-03-02

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2017, 12(3):232-237

Author Affiliation: College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China