靶向豬CLTC基因miRNA的預測與驗證

王亞莉，何 珂，于 靜，楊松柏，趙阿勇

（浙江農林大學 動物科技學院，浙江 臨安 311300）

靶向豬CLTC基因miRNA的預測與驗證

王亞莉，何 珂，于 靜，楊松柏，趙阿勇

（浙江農林大學 動物科技學院，浙江 臨安 311300）

網格蛋白介導的胞吞是病毒侵入細胞的重要途徑，網格蛋白重鏈（clathrin heavy chain,CLTC）是形成網格蛋白小窩結構的重要組成部分。針對CLTC基因的轉錄后調控特別是調控豬Sus scrofa CLTC的miRNA目前還不太清楚。本研究旨在篩選出調控豬CLTC基因的miRNA。利用生物信息學方法預測出6個靶向豬CLTC基因的miRNA，將豬CLTC基因3′UTR克隆至雙熒光素酶報告基因載體psiCHECK2中獲得雙熒光素酶報告基因重組載體psiCHECK2-CLTC-3′UTR。將預測得到的miRNA分別和重組載體psiCHECK2-CLTC-3′UTR共轉染到細胞中，以亂序序列作為陰性對照（NC），檢測miRNA對重組質粒熒光素酶活性的影響。結果發現miR-205，miR-1，miR-129-5p和miR-206均能夠顯著抑制熒光素酶活性（P＜0.05）。在豬腎上皮細胞系PK15細胞中超表達miR-1和miR-129-5p后，定量PCR（q-PCR）結果顯示：豬CLTC基因的表達量顯著下調。突變了psiCHECK2-CLTC-3′UTR載體中這4個miRNA的種子序列的結合位點發現：miR-1對突變質粒中的熒光素酶無顯著抑制作用。表明miR-1與豬CLTC基因有直接的靶向關系，并通過其種子序列抑制CLTC基因的表達。圖6表2參23

豬；CLTC；miRNA；胞吞；雙熒光素酶報告基因載體

miRNA是一類小的單鏈非編碼核糖核酸序列，長度為22～24個核苷酸，通過與靶基因3′UTR區域結合進而抑制靶基因的表達［1-3］。miRNA具有高度的保守性、時序性和組織特異性，能夠調控生物體特定的生理功能，在生物體生長、發育和疾病發生等過程中發揮著重要的作用［4］。網格蛋白（clathrin）介導的胞吞是信號分子進入細胞的主要途徑，也是病毒進入細胞的重要途徑。病毒侵入細胞是病毒增殖最為關鍵的一步，而網格蛋白介導的胞吞是病毒侵入細胞最主要也是最為典型的一種細胞胞吞途徑。網格蛋白又稱籠形蛋白［5］，由PEARSE在1975年首次分離得到并命名［6］。網格蛋白的1個重鏈（clathrin heavy chain,CLTC）和1個輕鏈組成一個二聚體，3個二聚體組成三聯體骨架結構，多個三聯體骨架結構組成五邊形或六邊形網格結構的包被亞基，最后由這些包被亞基構成多面體的網格蛋白包被的囊泡結構-小窩，病毒即是通過與小窩蛋白上的病毒受體結合進入細胞的［7］。如登革病毒（dengue virus,DNV）［8-9］，猴出血熱病毒（simian hemorrhagic fever virus,SHFV）［10］，丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）［11-13］，乙型腦炎病毒（japanese encephalitis virus,JEV）［14］，藍耳病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRSV）［15］，腸道病毒71型（enterovirus 71,EV-71）［16］等。該途徑的抑制能夠有效阻止病毒的感染，如用siRNA敲低CLTC基因，能夠有效阻斷乙腦病毒對豬Sus scrofa腎上皮細胞PK15的感染［14］。本研究旨在篩選出一批能夠靶向豬CLTC基因miRNA，從而為篩選廣譜抗病毒因子提供基礎。鑒于雙熒光素酶報告分析法的常規性和熒光定量的靈敏性，本研究結合2種方法，以增加基因篩選的可靠性。利用雙熒光素酶報告系統獲得靶向豬CLTC基因的miRNA：miR-205，miR-1，miR-129-5p和miR-206，并以點突變實驗鑒定出miR-1通過種子區結合靶向作用于豬CLTC基因3′UTR。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和載體

幼小倉鼠Mesocricetus auratus腎細胞系（BHK-21）和豬腎上皮細胞系（PK15）購自中國典型培養物保藏中心；雙熒光素酶檢測試劑盒和psiCHECK2載體均購自Promega；miRNA模擬物（miRNA mimics）購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；T4 DNA連接酶，DNA片段，限制性內切酶XholⅠ和NotⅠ購自Fermentas公司；SYBR Green試劑購自TOYOBO公司；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；引物由上海博尚生物技術有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 靶向豬CLTC基因miRNA的預測 根據miRBase（http：//www.mirbase.org）數據庫公布的豬miRNA（Release 21,2014），利用Targetscan（http：//www.targetscan.org），BioGps（http：//www.biogps.org）軟件進行miRNA的靶向分析；使用miRNAMap（http：//mirnamap.mbc.nctu.edu.tw）軟件鑒定miRNA的表達特異性，篩選出靶向豬CLTC基因3′UTR序列的miRNA，并合成相應的豬miRNA模擬物（上海吉瑪制藥技術有限公司）。

1.2.2 重組質粒的構建 利用美國生物技術信息中心（NCBI）數據庫中豬CLTC基因序列，設計引物并擴增豬CLTC基因3′UTR序列；采用XholⅠ和NotⅠ酶切位點，與psiCHECK2載體連接獲得雙熒光素酶報告載體，命名為Wild Type（WT）。設計miRNA種子區和豬CLTC基因3′UTR結合區的突變引物（表1），使用引物重疊聚合酶鏈式反應（PCR）的方法，以豬CLTC基因3′UTR片段為模板，擴增得到CLTC基因3′UTR的上下游片段；再以上下游同源臂的混合物作為模板，PCR擴增得到含有突變結合位點的CLTC基因3′UTR目的片段；與psiCHECK2載體連接，經測序驗證后獲得CLTC靶位點突變報告載體，命名為Mutant Type（MT）。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因實驗 用含10%胎牛血清（體積分數)的MEM（minimum essential media）培養基于體積分數為5%二氧化碳，37℃的環境條件下培養BHK-21細胞，并進行細胞傳代。轉染前一天將細胞接種至24孔板，接種密度為2.5×105個·孔-1，培養過夜后按照Lipofectamine 2000的說明書進行細胞瞬時轉染。設置8個實驗組：①無miRNA無轉染試劑的空白對照；②陰性對照（NC），WT；③miR-205，WT；④miR-1，WT；⑤miR-129-5p，WT；⑥miR-206，WT； ⑦miR-19a，WT；⑧miR-19b，WT。轉染24 h后，收集細胞，按照雙熒光檢測試劑盒說明書進行熒光檢測，計算螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性的比值，確定不同樣品之間報告基因的激活程度。同時測定每組3個平行孔之間的相對發光比率（RLU），計算標準誤差，統計不同轉染組之間的差異。

1.2.4 熒光定量PCR 以豬cDNA為模板設計擴增CLTC基因的定量引物，12孔板培養PK15細胞，接種密度為5×105個·孔-1，培養過夜后對細胞進行轉染。設置8個實驗組：①NC，WT；②miR-205，WT；③miR-1，WT；④miR-129-5p，WT；⑤miR-206，WT；⑥miR-19a，WT；⑦miR-19b，WT；⑧無miRNA無轉染試劑的空白對照。轉染48 h后收集細胞，Trizol試劑提取細胞總RNA，并反轉錄成cDNA，定量PCR檢測CLTC基因的mRNA的表達變化，統計每組CLTC基因的表達差異。

1.2.5 點突變雙熒光素酶報告基因檢測 用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測miRNA對點突變重組載體熒光素酶活性值的影響，實驗組設置如下：①無miRNA無轉染試劑的空白對照；②NC，WT；③miR-205，WT；④miR-205，MT；⑤miR-1，WT；⑥miR-1，MT；⑦miR-206，WT；⑧miR-206，MT；⑨miR-129-5p，WT；⑩miR-129-5p，MT。按照1.2.3進行雙熒光素酶報告基因檢測實驗。

1.3 數據分析

所有數據均以 “平均數±標準差”表示。統計學分析方法采用SAS 8.0的t檢驗和GLM方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。為消除誤差，設置重復3次·實驗組-1，取平均值。

2 結果與分析

2.1 生物信息學預測靶向豬CLTC基因的miRNA

利用生物信息學分析軟件，初步預測出與豬CLTC基因3’UTR有互補結合位點的6條miRNA：miR-205，miR-1，miR-129-5p，miR-206，miR-19a，miR-19b（表2），進行后續實驗驗證。

2.2 豬CLTC基因3′UTR雙熒光素酶報告基因載體與突變載體的構建

將豬CLTC基因3′UTR片斷和CLTC-3′UTR點突變片斷分別克隆至雙熒光酶報告基因載體psiCHECK2中，獲得重組質粒psiCHECK2-CLTC-3′UTR（圖1），并以鑒定引物進行菌液PCR鑒定。檢測長度為1 200 bp的豬CLTC基因3′UTR的雙熒光素酶載體（圖2）和豬CLTC基因3′UTR的雙熒光素酶靶標突變載體psiCHECK2-3′UTR-MT（圖3），測序驗證后提取質粒備用。

2.3 靶向豬CLTC-3′UTR的miRNA的篩選

雙熒光酶報告基因載體（WT）分別與6種miRNA模擬物共轉染BHK-21細胞，以NC為陰性對照，細胞培養24 h以后，雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性（圖4）。結果顯示：miR-205，miR-1，miR-206和 miR-129-5p能顯著降低熒光素酶活性值。miRNA模擬物轉染PK15細胞以后，熒光定量PCR檢測CLTC基因的表達量（圖5），結果顯示：miR-1和miR-129-5p能夠顯著降低CLTC基因mRNA的表達水平，而miR-205和miR-206與對照組相比，差異不顯著。

表2 與豬CLTC基因3′UTR可能結合的miRNATable 2 Potential miRNA targeting 3′UTR of porcine CLTC gene

2.4 靶向豬CLTC-3′UTR的miRNA的進一步確認

為了進一步驗證各miRNA與豬CLTC-3′UTR結合的靶位點，我們選取篩選出的miR-205，miR-1，miR-206，miR-129-5p做下一步的點突變實驗。將miRNA對豬CLTC基因3′UTR靶位點進行突變，其中miR-206和miR-1的靶位點相同，所以突變載體相同，分別構建miR-205，miR-129-5p，miR-1/ssc-miR-206對應CLTC靶點的突變載體。miRNA與突變載體（MT）或雙熒光報告基因載體（WT）共轉染BHK-21細胞后檢測熒光素酶活性。結果顯示：突變質粒psiCHECK2-CLTC-3′UTR和miR-1共轉染細胞后，與對照組相比，其熒光素酶活性得以恢復（圖6），說明miR-1通過種子區域作用于豬CLTC基因的3′UTR抑制其表達。

圖1 CLTC-3′UTR雙熒光素酶報告基因載體的構建圖譜Figure 1 Constructing ofluciferase reportergene vectors or porcine CLTC-3′UTR vectors

圖2 菌液PCR驗證豬CLTC-3′UTR雙熒光素酶報告基因載體Figure 2 Microbialvalidation ofluciferase reporter gene vectors

圖3 菌液PCR鑒定豬CLTC-3′UTR雙熒光素酶靶位點突變載體Figure 3 Microbial validation of porcine CLTC-3′UTR mutation vectors

3 結論與討論

miRNA廣泛存在于生物體內，對生物體的轉錄后基因表達調控起著關鍵的作用［17］。在植物細胞中，成熟的miRNA先與一種稱為RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）的復合物結合，再特異性地與目標mRNA結合，引起mRNA的降解；動物細胞中，大部分的miRNA與其靶mRNA不完全互補，miRNA則通過與對應的mRNA的3′端非翻譯區（3′UTR）結合阻止轉錄后的翻譯，起到調節基因表達的作用［18］。愈來愈多的研究證實，miRNA一般通過2種方式調控病毒在宿主細胞內的增殖，一種是miRNA直接靶向病毒的mRNA序列，抑制病毒相關基因的表達，這類miRNA已有相關的研究報道，如miR-323，miR-491，miR-654靶向甲型H1N1流感病毒（H1N1 subtype influenza A virus）［20］，miR-24和miR-93靶向水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）［21］。另一種是miRNA通過靶向宿主基因調節細胞內的信號通路進而阻止病毒的增殖，這類miRNA的研究集中在脂質代謝方面，如miR-27a通過靶向控制脂質合成和運輸的基因維甲酸X受體α（RXRα）和ATP結合盒轉運子A1（ABCA1）調控脂質代謝，從而抑制丙型肝炎病毒的復制［22］。截至目前，在miRBase數據庫軟件中已鑒定出的人類miRNA有1 881種，小鼠的有1 193種［19］，豬的有382種，但對豬miRNA的生物學功能尚不清楚。本研究利用生物信息學軟件預測出能夠與豬CLTC基因3′UTR靶向結合的6條miRNA：miR-205， miR-1，miR-206，miR-129-5p，miR-19a，miR-19b，利用雙熒光素酶報告基因法和熒光定量PCR法進一步篩選出能夠靶向配對的miRNA。結果顯示：miR-129-5p，miR-1在雙熒光報告基因實驗和熒光定量PCR中都能夠顯著降低CLTC基因的表達量，而miR-205，miR-206在雙熒光報告基因實驗中能夠顯著降低CLTC基因的表達量，但在熒光定量PCR中差異不顯著。為進一步驗證靶向豬CLTC基因的miRNA，我們設計了點突變載體，將miRNA和其對應點突變載體共轉染細胞檢測熒光素酶表達活性。結果顯示：miR-1通過種子區的結合而抑制靶基因豬CLTC基因的表達，miR-129-5p能夠抑制CLTC基因的表達，但突變載體的熒光活性并沒有得到恢復，說明miR-129-5p可能不是因為靶基因種子區的結合而抑制CLTC基因的表達，推測可能存在其他的靶作用位點。截至目前，有關miR-129-5p對病毒侵入細胞的研究鮮有報道，前期研究發現蝦miR-1通過抑制CLTC基因的表達調控細胞的吞噬作用［23］，推測本研究鑒定出的miR-129-5p可能在病毒侵入細過程中發揮重要作用。

圖4 miRNA模擬物與psiCHECK2-CLTC-3′UTR共轉染BHK-21細胞的相對熒光素酶活性Figure 4 Relative luciferase activity of psiCHECK2-CLTC-3′UTR reporter cotransfected with miRNA mimics in BHK-21 cells

圖5 定量PCR檢測miRNA模擬物轉染PK15細胞后CLTC基因的表達量Figure 5 CLTC gene expression was detected by q-PCR method after transfecting with miRNA mimics in PK15 cells

圖6 種子區突變前后4種miRNA模擬物對熒光素酶表達的影響Figure 6 Relative luciferase activity of different reporters in the presence or absence of miRNA seed sequence in BHK-21 cell

本研究成功構建了包含豬CLTC基因3′UTR的雙熒光酶報告基因載體和不同miRNA種子區域所對應的點突變報告載體，成功篩選出靶向豬CLTC基因的miR-1和miR-129-5p，利用點突變實驗最終確定miR-1通過種子區靶向結合豬CLTC基因并抑制其表達，研究結果為探究miRNA-CLTC基因-clathrin胞吞通路在抵抗病毒侵入宿主細胞的研究打下基礎，也為抗病候選基因的篩選提供了新的素材。

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Prediction and validation of miRNA targeting the porcine CLTC gene

WANG Yali,HE Ke,YU Jing,YANG Songbai,ZHAO Ayong
（College of Animal Science and Technology,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Clathrin heavy chain （CLTC）,an important component of clathrin-coated pits,plays an important role with virus invasion of cells;however,post-transcriptional gene regulation of the CLTC gene,especially porcine CLTC gene regulation by miRNA has not yet been clearly elucidated.This study aimed to screen miRNAs that target the CLTC gene.First,bioinformatics predicted that miR-205,miR-1,miR-129-5p,miR-206,miR-19a,and miR-19b targeted the porcine CLTC gene.Then porcine CLTC 3′UTR was cloned into the psiCHECK2vector,and the dual luciferase reporter recombinant vector psiCHECK2-3′UTR was constructed. The prediction of miRNA and the recombinant vector psiCHECK2-3′UTR were co-transfected into cells, respectively,with the scramble sequence of miRNA as a negative control（NC）;then the luciferase activity was detected.A quantitative PCR（q-PCR）was also used to determine the expression of CLTC mRNA levels.Then to verify whether miRNA regulated the porcine CLTC gene through seed sequences,binding sites of psiCHECK2-3′UTR with seed sequence were mutated.Results showed that miR-205,miR-1,miR-129-5p,and miR-206 were able to significantly inhibit luciferase activity （P＜0.05）.At the same time there was an overexpression of miR-1 and miR-129-5p in PK15 cells,and the q-PCR showed that the expression of CLTC mRNA level was significantly reduced （P＜0.05）.Verification of whether the four miRNA （miR-205,miR-1,miR-129-5p,and miR-206） regulated the porcine CLTC gene through seed sequences showed that miR-1 mutant plasmid did not inhibit the luciferase activity.Thus,the results demonstrated that miR-1 inhibited porcine CLTC gene expression through its seed sequence binding with CLTC 3′UTR.［Ch,6 fig.2 tab.23 ref.］

porcine;CLTC;miRNA;endocylosis;dual luciferase reporter gene vector

S852

A

2095-0756（2017）03-0389-06

浙 江 農 林 大 學 學 報，2017，34（3）：389-394

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.002

2016-05-31；

2016-07-13

國家自然科學基金青年基金資助項目（31501921）；浙江省自然科學基金青年基金資助項目（LQ15C170001）；浙江農林大學科研發展基金資助項目（2014FR068）

王亞莉，從事豬分子育種研究。E-mail：wangyali19890204@163.com。通信作者：趙阿勇，教授，博士，從事動物數量遺傳與分子育種研究。E-mail：zay503@zafu.edu.cn。楊松柏，博士，從事分子生物學與豬育種研究。E-mail：sbyang@zafu.edu.cn