卡維地洛對非酒精性脂肪肝病大鼠脂聯素表達的影響

劉娜+梁傳棟+劉英姣

【摘要】 目的 探討卡維地洛對非酒精性脂肪肝病（NAFLD）大鼠脂聯素表達的影響。方法 40只雄性SD大鼠隨機分為對照組（10只）、模型組（10只）和治療組（20只）。采用高脂飲食建立非酒精性脂肪肝病大鼠模型， HE染色觀察大鼠肝臟病理學變化；應用蛋白質印跡法（Western blot法）檢測卡維地洛對非酒精性脂肪肝病大鼠模型肝組織脂聯素蛋白表達的影響；應用實時熒光定量PCR技術檢測對其mRNA表達的作用。結果 三組病理學檢查：①大體形態：對照組肝臟呈鮮紅色， 表面光滑有光澤， 邊緣規則銳利， 質地軟；模型組肝臟體積增大， 邊緣變鈍， 切面油膩狀；治療組肝臟與模型組相比油膩狀減輕， 邊緣較清晰， 指壓有彈性。②組織學變化：對照組大鼠肝組織切片HE染色肝索排列整齊， 肝細胞無變性壞死， 結構完整；模型組大鼠肝組織切片可見彌漫性肝細胞脂肪變性， 脂質沉積， 空泡變性， 排列紊亂， 局部見纖維組織增生， 匯管區炎癥明顯；治療組肝臟病理有不同程度的改善， 輕度至中度脂肪變為主， 肝細胞形態大致正常， 肝內脂肪滴減少。治療組4周與8周的脂肪變及炎癥活動度與模型組相比， 差異具有統計學意義（P<0.05）。模型組大鼠肝組織脂聯素表達與對照組相比明顯降低， 差異具有統計學意義[（0.59±0.12） VS （1.28±0.11）， t=-13.404， P<0.01]；卡維地洛治療4周組和8周組脂聯素表達明顯升高， 與模型組相比差異有統計學意義[（1.24±0.13） VS （0.59±0.12）， t=11.618， P<0.01；（1.39±0.11） VS （0.59±0.12）， t=15.541， P<0.01]。模型組脂聯素mRNA表達水平明顯低于對照組， 差異具有統計學意義[（0.72±0.06） VS （1.00±0.08）， t=-8.854， P<0.01]；卡維地洛治療4周組和8周組脂聯素mRNA表達明顯高于模型組， 差異具有統計學意義[（1.34±0.09） VS （0.72±0.06）， t=18.126， P<0.01；（1.97±0.08） VS （0.72±0.06）， t=39.528， P<0.01]。結論 卡維地洛能明顯改善NAFLD大鼠肝臟病變程度， 同時使肝臟表達脂聯素升高， 從而為非酒精性脂肪肝病的治療提供了新的途徑。

【關鍵詞】 非酒精性脂肪肝病；卡維地洛；脂聯素；大鼠

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.13.109

【Abstract】 Objective To investigate influence by carvedilol on expression of adiponectin in rats with nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Methods A total of 40 male SD rats were randomly divided into control group （10 rats）， model group （10 rats） and treatment group （20 rats）. Nonalcoholic fatty liver disease rat model was built by high fat diet， and HE staining was applied to observe pathological changes in liver of rats. Western blot method was applied to detect influence by carvedilol on expression of adiponectin in rats with nonalcoholic fatty liver disease. Real-time fluorescence quantification polymerase chain reaction （PCR） was applied to detect effect for mRNA. Results Pathological examination in the three groups： ① Gross morphology： the control group had bright red liver with smooth and glossy surface， regular and sharp edge and soft texture. The model group had enlarged liver， with blunt edge and oleaginous section. The treatment group had slighter oleaginous section and clearer edge， with elasticity. ② Histological change： the control group had regular hepatic cords in HE staining of liver tissue slice with no degenerative necrosis in liver cell and complete structure. The model group had diffuse hepatic cell fatty degeneration in liver tissue slice， with lipidosis， vacuolar degeneration， disorder arrangement， local proliferation of fibrous tissue， and obvious portal area inflammation. The treatment group had different degree of improvement in liver pathology， with mainly mild and moderate fatty change， normal liver cellular morphology， and reduction of intrahepatic fat granule. Comparison of fatty change and inflammation grade between the treatment group and the model group showed statistically significant difference （P<0.05）. The model group had obviously lower expression of adiponectin in liver tissue than the control group in 4 weeks and 8 weeks of treatment， and their difference had statistical significance [（0.59±0.12） VS （1.28±0.11）， t=-13.404， P<0.01]. In 4 weeks and 8 weeks of treatment by carvedilol， the treatment group had obviously higher expression of adiponectin. Comparing with the model group， their difference had statistical significance [（1.24±0.13） VS （0.59±0.12）， t=11.618， P<0.01； （1.39±0.11） VS （0.59±0.12）， t=15.541， P<0.01]. The model group had much lower expression of adiponectin mRNA than the control group， and the difference had statistical significance [（0.72±0.06） VS （1.00±0.08）， t=-8.854， P<0.01]. In 4 weeks and 8 weeks of treatment by carvedilol， the treatment group had obviously higher expression of adiponectin mRNA than the model group， and the difference had statistical significance [（1.34±0.09） VS （0.72±0.06）， t=18.126， P<0.01； （1.97±0.08） VS （0.72±0.06）， t=39.528， P<0.01]. Conclusion Carvedilol can remarkably improve liver lesion degree in NAFLD rats， along with increased expression of adiponectin in liver. It provides a new pathway in treating nonalcoholic fatty liver disease.

【Key words】 Nonalcoholic fatty liver disease； Carvedilol； Adiponectin； Rats

非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease， NAFLD） 是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征， 目前尚缺乏防治NAFLD的有效措施。非酒精性脂肪肝病患者血清脂聯素水平降低， 并且有可能受交感神經遞質的參與調節[1]?？ňS地洛為腎上腺素α、β受體阻斷劑， 阻斷受體的同時具有舒張血管作用?？ňS地洛是否可以影響NAFLD大鼠肝組織脂聯素的表達， 進而影響NAFLD的疾病進展仍不明確。本研究通過檢測卡維地洛對NAFLD大鼠肝組織脂聯素表達的影響， 進而為NAFLD的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試劑與藥物 卡維地洛片劑購自上海羅氏制藥有限公司（批號MH6282603）；兔抗人脂聯素抗體和兔抗人β-Actin抗體購于武漢博士德生物工程有限公司；RNA提取TRIZOL試劑盒為羅氏公司（ROCHE）產品；逆轉錄反應體系、SYBR Green RealMasterMix購自北京天根公司；Taq 酶、 DNaseI 購自寶生物公司（TaKaRa）， 其余均為國產分析純試劑。所用PCR引物由威斯騰生物技術公司合成。

1. 2 實驗動物分組以及模型制備 SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠40只（購于河北省人民醫院實驗動物中心）， 體質量180～200 g。隨機分為對照組（10只）、模型組（10只）、治療組（20只）。對照組給予基礎飼料喂養；模型組和治療組大鼠均給予高脂飼料（88%基礎飼料+2%膽固醇+10%豬油）喂養， 自由進食水[2]， 第4、8、12周各處死1只模型組大鼠做肝臟病理HE染色， 以判斷造模情況。卡維地洛片用生理鹽水配置成濃度為25 mg/dl 的藥液， 結合預實驗情況， 給予造模成功的治療組大鼠1 mg/（kg·d）分2次灌胃， 分別干預4、8周；對照組及模型組同時灌等量蒸餾水。遵循中國科學技術委員會制定的《實驗動物管理條例》進行實驗操作。

1. 3 標本處理 麻醉動物后結扎剪斷肝門管道系統， 取出大鼠肝臟， 沖洗后置于無菌培養皿中。①切取肝左葉約1 mm×1 mm×1 mm組織3塊， 4%戊二醛固定；②左葉肝組織浸入多聚甲醛或福爾馬林液中固定；③右葉肝組織稱重記錄分裝后， 置于無菌凍存管液氮冰凍保存。

1. 4 方法

1. 4. 1 組織病理學檢測 肝組織石蠟包埋， 切片后行常規HE染色， 在光學顯微鏡下觀察肝臟病理學改變， 每張切片隨機觀察10個視野， 根據Diehl法進行肝細胞脂肪變性程度分級[3]。根據Knodell提出的慢性肝炎組織學活動指數（histological activity index， HAI）進行炎癥活動度計分。

1. 4. 2 Western blot檢測脂聯素蛋白的變化 提取肝組織總蛋白， 考馬斯亮藍比色法測定蛋白含量。聚丙烯胺凝膠（10% 分離膠和4% 濃縮膠）電泳， 60伏恒壓轉膜2 h， 分別以兔抗人脂聯素抗體（1∶200）和兔抗人β-Actin多克隆抗體（1：200）作為第一抗體；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（1∶5000）作為第二抗體進行反應， 超敏發光液顯影；將膠片進行掃描， 用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1. 4. 3 Real-time Q-PCR檢測卡維地洛對肝組織表達脂聯素的影響 ①按照TRIZOL Reagent 液說明書提取總RNA， 然后用紫外分光光度計定量。按照試劑盒說明書進行 cDNA的逆轉錄?？?RNA 經 RT反應后進行PCR擴增；脂聯素及內參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）引物利用Primer Premier 5 軟件自行設計， 序列通過BLAST進行比對具有特異性， 引物合成由威斯騰生物技術公司完成。具體如下：脂聯素（上游引物：5′-AATCCTGCCCAGTCATGAAG-3′， 下游引物：5′- CATCTCCTGGGTCACCCTTA -3′， 擴增片段362 bp）。GAPDH（上游引物：5′-CATCCTGCGTCTGGACCT-3′， 下游引物為 5′-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3′， 擴增片段 499 bp）。②在PE5700實時熒光定量PCR儀上進行實時定量擴增。SYBR反應體系25 μl：2.5×RealMasterMix 10 μl， 20×SYBR solution 1.25 μl， 上游引物 0.5 μl， 下游引物 0.5 μl， DNA模板2 μl， 不足用DEPC水補齊。反應條件為：95℃預變性 5 min， 95℃ 30 s， 59℃ 40 s， 72℃ 1 min， 30 次循環， 72℃延伸 10 min。采用實時熒光定量PCR儀相應軟件程序記錄、分析檢測數據。

1. 5 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 肝臟組織病理學檢查 ①大體形態：對照組肝臟呈鮮紅色， 表面光滑有光澤， 邊緣規則銳利， 質地軟；模型組肝臟體積增大， 邊緣變鈍， 切面油膩狀；治療組肝臟與模型組相比油膩狀減輕， 邊緣較清晰， 指壓有彈性。②組織學變化：對照組大鼠肝組織切片HE染色肝索排列整齊， 肝細胞無變性壞死， 結構完整；模型組大鼠肝組織切片可見彌漫性肝細胞脂肪變性， 脂質沉積， 空泡變性， 排列紊亂， 局部見纖維組織增生， 匯管區炎癥明顯；治療組肝臟病理有不同程度的改善， 輕度至中度脂肪變為主， 肝細胞形態大致正常， 肝內脂肪滴減少。治療組4周與8周的脂肪變及炎癥活動度與模型組相比， 差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1， 圖1。

2. 2 Western blot 檢測脂聯素蛋白的變化 模型組大鼠肝組織脂聯素表達與對照組相比明顯降低， 差異具有統計學意義[（0.59±0.12） VS （1.28±0.11）， t=-13.404， P<0.01]， 卡維地洛治療4周組和8周組脂聯素表達明顯升高， 與模型組相比差異有統計學意義[（1.24±0.13） VS （0.59±0.12）， t=11.618， P<0.01；（1.39±0.11） VS （0.59±0.12）， t=15.541， P<0.01]。見表2， 圖2。

2. 3 Real-time Q-PCR檢測卡維地洛對肝組織表達脂聯素的影響 在PCR擴增的指數時期， 模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系， 故應用2-△△Ct法比較各組肝組織中的脂聯素mRNA的表達情況。結果證實， 模型組脂聯素mRNA表達水平明顯低于對照組， 差異具有統計學意義[（0.72±0.06） VS（1.00±0.08）， t=-8.854， P<0.01]；卡維地洛治療4周組和8周組脂聯素mRNA表達明顯高于模型組， 差異具有統計學意義[（1.34±0.09） VS （0.72±0.06），t=18.126， P<0.01；（1.97±0.08） VS （0.72±0.06）， t=39.528， P<0.01]。見表3， 圖3。

3 討論

非酒精性脂肪肝病是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征， 與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的獲得性代謝應激性肝損傷[4， 5]。包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎及其相關肝硬化。近年來， 隨著肥胖及其相關代謝綜合征全球化的流行趨勢， NAFLD的發病率呈明顯上升趨勢。脂肪組織不僅參與能量代謝， 還能以內分泌、旁分泌和自分泌的形式分泌大量脂肪因子， 包括瘦素（leptin）、脂聯素（adiponectin， APN）、抵抗素、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）α、白細胞介素6（IL-6）、纖溶酶原激活劑抑制物、胰島素樣生長因子1等 [6， 7]。研究發現， 脂聯素參與了脂肪肝、肝炎、肝纖維化及肝硬化等慢性肝病的發生和發展， 已經成為肝病研究領域的熱點[8， 9]。非酒精性脂肪肝病患者血清瘦素水平明顯升高， 目前認為是NAFLD患者普遍存在胰島素抵抗和（或）瘦素抵抗所致[10]。脂聯素是一種胰島素增敏激素， 能改善小鼠的胰島素抗性和動脈硬化癥， 是機體脂肪代謝和血清穩態調控網絡的重要調節因子。對人體的研究發現， 脂聯素水平能預示2型糖尿病和冠心病的發展。肝病領域研究發現， 酒精性脂肪肝病大鼠脂聯素水平降低， 這有可能是肝臟疾病進展的重要標志 [11]。而血清脂聯素水平升高， 則可能有利于 NAFLD 的控制。

交感神經系統的過度活化已經證實參與了肝臟疾病的發生和發展[12， 13]。而脂聯素作為肝臟的調節因子， 對肝臟的作用也需要交感神經遞質的參與[14， 15]。新一代腎上腺素受體阻滯劑卡維地洛阻斷受體的同時還具有外周擴血管作用[16]。近年來， 卡維地洛在非酒精性脂肪肝病方面的研究也屢見報道。作者前期研究發現， 卡維地洛能明顯改善實驗性大鼠肝纖維化程度， 同時下調大鼠肝臟中瘦素以及瘦素受體的水平[17]。在本研究中三組病理學檢查：①大體形態：對照組肝臟呈鮮紅色， 表面光滑有光澤， 邊緣規則銳利， 質地軟；模型組肝臟體積增大， 邊緣變鈍， 切面油膩狀；治療組肝臟與模型組相比油膩狀減輕， 邊緣較清晰， 指壓有彈性。②組織學變化：對照組大鼠肝組織切片HE染色肝索排列整齊， 肝細胞無變性壞死， 結構完整；模型組大鼠肝組織切片可見彌漫性肝細胞脂肪變性， 脂質沉積， 空泡變性， 排列紊亂， 局部見纖維組織增生， 匯管區炎癥明顯；治療組肝臟病理有不同程度的改善， 輕度至中度脂肪變為主， 肝細胞形態大致正常， 肝內脂肪滴減少。治療組4周與8周的脂肪變及炎癥活動度與模型組相比， 差異具有統計學意義（P<0.05）。模型組大鼠肝組織脂聯素表達與對照組相比明顯降低， 差異具有統計學意義[（0.59±0.12） VS （1.28±0.11）， t=-13.404， P<0.01]；卡維地洛治療4周組和8周組脂聯素表達明顯升高， 與模型組相比差異有統計學意義[（1.24±0.13） VS （0.59±0.12）， t=11.618， P<0.01；（1.39±0.11） VS （0.59±0.12）， t=15.541， P<0.01]。模型組脂聯素mRNA表達水平明顯低于對照組， 差異具有統計學意義[（0.72±0.06） VS （1.00±0.08）， t=-8.854， P<0.01]；卡維地洛治療4周組和8周組脂聯素mRNA表達明顯高于模型組， 差異具有統計學意義[（1.34±0.09） VS （0.72±0.06）， t=18.126， P<0.01；（1.97±0.08） VS （0.72±0.06）， t=39.528， P<0.01]。證實， 應用高脂飲食法成功建立大鼠NAFLD動物模型， 模型組大鼠肝組織脂聯素蛋白及mRNA 表達均明顯減少， 說明脂聯素表達確實參與了大鼠肝臟脂肪變進程。給予脂肪肝大鼠卡維地洛治療后， 大鼠脂肪變程度減輕， 病理分級明顯改善， 說明卡維地洛可以改善NAFLD的肝臟病變程度， 進一步證實交感神經系統確實參與了NAFLD疾病的進展。卡維地洛治療后， 肝組織脂聯素表達水平升高， 肝臟病變減輕， 可能是由于卡維地洛通過交感神經阻滯作用， 從而干預了脂聯素的表達， 具體調節機制尚需要進一步的探討， 以便為臨床上非酒精性脂肪肝病的治療提供新的途徑。

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[收稿日期：2017-02-28]