三倍體無籽西瓜子葉節再生體系建立與嫁接育苗技術探究

閔子揚，阮萬輝，張屹，朱菲瑩，肖姬玲，李基光，劉建雄，梁志懷

（湖南省西瓜甜瓜研究所長沙410125）

三倍體無籽西瓜子葉節再生體系建立與嫁接育苗技術探究

閔子揚，阮萬輝，張屹，朱菲瑩，肖姬玲，李基光，劉建雄，梁志懷

（湖南省西瓜甜瓜研究所長沙410125）

以三倍體無籽西瓜品種‘超庭三號’子葉節為外植體，對影響子葉節離體再生及嫁接育苗技術的關鍵因子進行了研究。結果表明，3%的次氯酸鈉溶液消毒18 min是三倍體無籽西瓜種胚消毒的最佳方式；2.5 mg·L-16-BA+ 0.1 mg·L-1NAA是誘導三倍體無籽西瓜子葉節產生不定芽的最佳激素組合，不定芽分化系數最高達6.11；0.2 mg·L-1KT能有效誘導不定芽伸長；將長度為2.5 cm的接穗嫁接到子葉剛展平的南瓜砧木上，成活率高達84.40%。試驗成功建立了三倍體無籽西瓜子葉節再生及嫁接育苗技術體系。

無籽西瓜；三倍體；子葉節；再生體系；嫁接

中國是世界上西瓜（Citrullus lanatus）生產與消費第一大國[1]，市場潛力巨大，其中三倍體無籽西瓜具有比普通二倍體西瓜糖度更高、食用更加方便、宜于機械化采收、區域流動性強等優點[2]，更加契合我國西瓜產業發展的需求，因此逐年受到人們的重視。但是，三倍體無籽西瓜生產中存在采種量低、發芽率低、成苗率低的“三低”問題，導致三倍體無籽西瓜種子價格昂貴、育苗技術性強，嚴重制約我國無籽西瓜產業的發展。組織培養技術的快速發展為打破三倍體無籽西瓜“三低”問題帶來了曙光，利用該技術可在短時間內獲得大量優質無籽西瓜試管苗，大大簡化三倍體無籽西瓜繁瑣的育苗程序，降低生產成本，帶來顯著的社會效益和經濟效益。

前人關于三倍體無籽西瓜子葉節再生及嫁接育苗的研究已有報道，研究內容主要集中在外植體的選擇、誘導培養基的篩選等方面，但建立的再生體系并不完善，存在誘導出芽率低、受外植體基因型影響大、再生植株移栽成活困難等問題[3-5]。筆者在建立高效不定芽誘導體系的基礎上，對所得不定芽不進行生根誘導而是直接進行嫁接，目的是建立一套穩定、高效的三倍體無籽西瓜子葉節再生及嫁接育苗技術體系，以期在降低三倍體無籽西瓜生產用種量、簡化育苗程序、工廠化生產嫁接苗、提高品種純度等方面奠定基礎，同時也為西瓜基因工程相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試三倍體無籽西瓜品種為‘超庭三號’，購于新疆科世達種業有限公司，該品種生長勢強健，瓤黃色，品質優良，單瓜質量7～11 kg；砧木為西瓜嫁接專用品種‘白籽南瓜’。試驗于2015年9月在湖南省西瓜甜瓜研究所組織培養實驗室進行，嫁接后植株置于嫁接愈合室直至植株成活。

1.2 方法

1.2.1 消毒時間對種胚污染率和發芽率的影響選取質量較好的‘超庭三號’無籽西瓜種子，小心剝去種殼并盡量不傷及種胚，首先在25℃的恒溫水中浸種4～6 h，然后將其在超凈工作臺上用75%的酒精表面消毒30 s、無菌水沖洗3次，再置于3%的次氯酸鈉溶液中分別消毒12、15、18、21 min，以觀察不同消毒時間對種胚污染率和發芽率的影響。消毒期間不斷攪拌以加強消毒效果，無菌水沖洗5～6次后用無菌濾紙吸干種胚表面水分，接種到不添加任何激素的MS培養基上進行暗培養4 d，待種胚發芽后轉入光下培養，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光強2 500 lx，整個培養期間一直處于（25±1）℃的溫度條件下。以上各項每處理均接種30粒種胚，3次重復。

1.2.2 不同激素組合對三倍體無籽西瓜不定芽誘導及伸長的影響以光培養2 d的三倍體無籽西瓜種胚為材料，整體切取其子葉節部分為外植體[6]，將其接種于不同質量濃度6-BA（2.00、2.50、3.00 mg·L-1）和NAA（0.05、0.10、0.15 mg·L-1）組成的誘導培養基中，探究誘導不定芽增殖的最佳激素組合；將誘導出的不定芽切割成單芽，接種于含不同質量濃度的NAA（0.10、0.20、0.30 mg·L-1）或KT（0.10、0.20、0.30 mg·L-1）的培養基中，探究適宜于不定芽伸長的最佳培養基。不定芽誘導及伸長過程中，均以MS培養基為基本培養基，pH值5.8，添加30 g·L-1的蔗糖、7 g·L-1的瓊脂粉，整個培養期間均置于光照16 h·d-1，光強2 500 lx，溫度（25±1）℃的環境中進行培養。培養30 d后統計不定芽誘導率，不定芽轉接14 d后記錄不定芽伸長效果。以上各項每處理均接種20個外植體，3次重復。

1.2.3 影響嫁接成活因素的探究采用頂插接的方法，將經過適應性鍛煉后、長度不同（2.0、2.5、3.0 cm）的單個不定芽嫁接到子葉剛展平的南瓜砧木上，以探究試管苗大小對嫁接成活率的影響。將嫁接苗置于嫁接愈合室中，前3 d嚴格蓋膜以保持濕度100%，白天溫度（27±1）℃，夜間溫度（25±1）℃，5～6 d后逐漸通風降溫，其他同嫁接苗常規管理，長出新葉后視為嫁接成活。以上各項每處理取嫁接苗30株，3次重復，14 d后統計不同處理間嫁接成活率。

1.2.4 數據統計及分析以上試驗取得的試驗數據按下列公式計算污染率等指標。

污染率/%=（污染外植體數/接種外植體總數）× 100；

不定芽誘導率/%=（出芽外植體數/接種外植體總數）×100；

不定芽分化系數/%=（形成不定芽總個數/出芽外植體總數）×100；

建設智慧校園旨在推動下一代數字技術在智慧校園建設中的創新應用，改造和優化現行校園網絡環境，構建高速泛在、智能靈活、開放共享、安全可靠的校園信息環境。2015年以來，學校啟動了智慧校園建設，并將智慧校園建設列入學校“十三五”規劃重點項目，設立智慧校園建設專職系統集成、軟件研發和推廣團隊，保障智慧校園試點項目順利實施。

嫁接成活率/%=（嫁接成活植株數/總嫁接植株數）×100；

采用SPSS 17.0軟件對以上各數據進行方差分析和Duncan’s多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對三倍體無籽西瓜種胚污染率及發芽率的影響

外植體用75%的酒精消毒30 s后，再用不同時間的3%次氯酸鈉溶液消毒，以探究最佳消毒方式。從表1中可以看出，當消毒時間為12 min時，污染率高達63.33%，與其他處理之間存在顯著差異；雖然剩余未污染外植體萌芽率較高，但由于大部分外植體已經污染，其總體萌芽率處于所有處理的最低值，為31.13%，顯著低于其他處理。隨著消毒時間延長，外植體的污染率逐漸降低，當消毒時間達到21 min時，污染率降為0，但是此時次氯酸鈉溶液對種胚的毒害作用同樣加強，導致種胚的萌芽率只有64.40%，顯著低于消毒18 min時。消毒時間為18 min時，外植體污染率僅為2.22%，與消毒21 min時差異不顯著，消毒效果較好，并且此時種胚萌芽率在所有處理中達到最高值，為82.21%，顯著高于其他處理。綜上分析認為，在3%的次氯酸鈉溶液中消毒18 min，是三倍體無籽西瓜種胚消毒的最佳方式。

表1 不同消毒時間對三倍體無籽西瓜種胚污染率及發芽率的影響

2.2 不同激素組合對不定芽增殖的影響

外源激素是誘導西瓜子葉節產生不定芽的必要物質，其種類及配比對不定芽誘導率和分化系數起決定性作用。

由表2可知，NAA質量濃度一定時，隨著6-BA質量濃度的增加，不定芽誘導率和分化系數均逐漸升高，當6-BA質量濃度為3.0 mg·L-1時，不定芽誘導率最高，達85.02%，分化系數6.03，但其與6-BA質量濃度為2.5 mg·L-1時的不定芽誘導率和分化系數之間差異不顯著，均處于較高水平，但6-BA質量濃度3.0 mg·L-1時誘導出的芽大部分為葉叢芽，沒有莖的產生，不利于后期單芽的伸長及嫁接，故6-BA質量濃度為2.5 mg·L-1時較適宜不定芽的誘導。當6-BA質量濃度一定時，隨著NAA質量濃度的增加，不定芽誘導率呈先增后降的趨勢，說明低質量濃度的NAA有利于不定芽的生長，但質量濃度過高時則抑制其生長。在與6-BA組合使用過程中發現，NAA質量濃度為0.1 mg·L-1時不定芽誘導率均呈現出明顯優勢，因此NAA質量濃度0.1 mg·L-1較適宜西瓜不定芽的誘導。綜上分析，2.5 mg·L-16-BA+ 0.1 mg·L-1NAA是誘導三倍體無籽西瓜子葉節產生不定芽的最佳激素組合（圖1-A）。

表2 不同激素組合對誘導分化不定芽的影響

2.3 不同激素對不定芽伸長的影響

分別使用3種不同質量濃度的NAA或KT進行不定芽伸長誘導試驗，結果表明，不同質量濃度的NAA或KT均能誘導不定芽的伸長，但是以NAA進行誘導時不定芽生長速度緩慢，基部出現愈傷化不定根并隨著NAA質量濃度的增加愈傷化程度逐漸加重（圖1-B），不利于后期嫁接；以KT進行誘導時，不定芽生長迅速、莖稈健壯且基部無愈傷組織形成（圖1-C），后期嫁接成活率高，其質量濃度以0.2 mg·L-1較為適宜，過高時不定芽生長瘦弱，不利于成活。

2.4 接穗長度對嫁接成活率的影響

由表3可知，接穗長度為2.5 cm時，嫁接成活率最高，達84.40%，與其他2種接穗長度之間存在顯著差異。接穗長度為2.0 cm左右時生長勢較弱，木質化程度低，維管束發育不完全，不能很好的跟砧木貼合，導致嫁接成活率較低。接穗長度為3.0 cm左右時，不定芽生長時間較長且莖稈較粗，不易插入砧木，同樣影響成活率。本試驗沒有進行砧木大小對嫁接成活率影響的研究，主要因為南瓜砧木的下胚軸很容易出現中空現象，砧木苗齡過大時嫁接成活率急劇降低。綜上認為，接穗長度為2.5 cm時嫁接到子葉剛展平的南瓜砧木上是三倍體無籽西瓜組培苗適宜的嫁接條件（圖1-D）。

圖1 子葉節誘導出芽及嫁接成活過程

表3 不同接穗長度對嫁接成活率的影響

3 討論與結論

在三倍體無籽西瓜再生體系建立的過程中，可使用的外植體種類很多，目前已報道的有莖尖、芽、下胚軸、子葉等，但是普遍存在誘導率較低的問題。筆者以三倍體無籽西瓜的子葉節為外植體，不定芽誘導率高達83.32%、分化系數達6.11，說明子葉節是適宜建立三倍體無籽西瓜再生體系的外植體類型，這與張慧君等[7]在甜瓜上的研究結論是一致的。

6-BA是三倍體無籽西瓜再生體系建立過程中必不可少的激素，其濃度對誘導率的高低及芽的質量起決定性作用，濃度較低時不定芽誘導率低，過高時則容易形成葉叢芽，不利于后期成苗。適宜質量濃度的NAA或KT均能誘導不定芽的伸長，但以0.2 mg·L-1的KT進行誘導時，不定芽生長健壯、基部無愈傷組織形成，有利于后期嫁接成活，這與肖守華等[8]的結論一致。

接穗長度是影響嫁接苗成活率的關鍵因子[9]，筆者將經過適應性鍛煉后、長度2.5 cm左右的不定芽嫁接到子葉剛展平的南瓜砧木上，嫁接成活率高達84.4%，并且此方法省去了試管苗誘導生根、煉苗移栽、馴化成活等步驟，提高了生產效率，能有效應用于生產實踐。試驗過程中也發現一些問題，如部分試管苗莖稈較實生苗粗壯，作為接穗時不能緊密的插入砧木，造成試管苗嫁接利用率低；試管苗生產周期長、嫁接后緩苗時間長等問題有時會導致生產出的嫁接苗趕不上農時，制約了該項技術的應用。提高接穗可利用率、簡化嫁接程序及加強嫁接后管理需進一步深入探究。

本研究結果表明，以三倍體無籽西瓜子葉節為外植體可建立高效的再生體系，其最佳誘導培養基為2.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，不定芽分化系數最高可達6.11。誘導獲得的不定芽在MS+ 0.2 mg·L-1KT的培養基中生長迅速且狀態好，有利于后期的嫁接。將長度為2.5 cm的接穗嫁接到子葉剛展平的南瓜砧木上，成活率高達84.40%。本試驗成功建立了三倍體無籽西瓜子葉節再生及嫁接育苗技術體系，在降低三倍體無籽西瓜生產用種量、簡化育苗程序、工廠化生產嫁接苗、提高品種純度等方面奠定了基礎，同時也可為西瓜基因工程相關研究提供參考。

[1] 劉文革，何楠，趙勝杰，等．我國三倍體無籽西瓜的周年生產與栽培[J]．長江蔬菜，2014（14）：1-6．

[2] 趙姜．中國西瓜產業發展的經濟學分析[D]．北京：中國農業科學院，2013．

[3] 王闖，李中勇，劉敏，等．無籽西瓜莖段組織培養與嫁接育苗技術研究[J]．中國農學通報，2010，26（5）：189-192．

[4] 湯月豐，周泉，馬陸平．無籽西瓜組織培養與嫁接育苗技術研究[J]．湖南農業科學，2006（5）：43-44．

[5] 許念芳，劉少軍，藏傳江，等．無籽西瓜的組培快繁技術研究[J].山東農業科學，2013，45（7）：12-14．

[6] 閻志紅，劉文革，趙勝杰，等．四倍體西瓜子葉植株再生試驗[J].中國果樹，2007（6）：28-31．

[7] 張慧君，高鵬，欒非時．甜瓜自交系離體子葉節再生體系的建立[J]．江蘇農業科學，2012，40（3）：50-52．

[8] 肖守華，李國生，焦自高，等．西瓜高效再生體系的建立[J]．中國瓜菜，2010，23（3）：11-14．

[9] 李建欣，龐淑敏，李建吾，等．黃瓜組織培養與組培苗嫁接研究[J]．農業科技通訊，2012（2）：60-63．

·書訊·

《甜瓜種質資源描述規范和數據標準》由中國農業科學院鄭州果樹研究所主持編寫，并得到了全國甜瓜科研、教學和生產單位的大力支持。甜瓜種質資源描述規范和數據標準的制定是國家農作物種質資源平臺建設的重要內容，共分三大部分，其中甜瓜種質資源描述規范規定了甜瓜種質資源的描述符及其分級標準，以便對甜瓜種質資源進行標準化整理和數字化表達。甜瓜種質資源數據標準規定了甜瓜種質資源各描述符的字段名稱、類型、長度、小數位、代碼等，以便建立統一的、規范的甜瓜種質資源數據庫。甜瓜種質資源數據質量控制規范規定了甜瓜種質資源數據采集全過程中的質量控制內容和質量控制方法，以保證數據的系統性、可比性和可靠性。

郵購價:32元(含掛號費)；郵購地址：鄭州市未來路南端中國農業科學院鄭州果樹研究所；收款人：雜志社；電話：0371-65330982。

Establishment of the cotyledon node regeneration system and vitrografting technology in triploid seedless watermelon

MIN Ziyang，RUAN Wanhui，ZHANG Yi，ZHU Feiying，XIAO Jiling，LI Jiguang，LIU Jianxiong，LIANG Zhihuai
（Hunan Watermelon and Muskmelon Institute，Changsha 410125，Hunan，China）

In this paper，we used seedless watermelon‘Chaoting No.3’cotyledonary node as explants for the establish?ment of seedless watermelon cotyledon node regeneration and grafting breeding technology system to investigate the key fac?tors affecting cotyledon node regeneration in vitro and the grafting seedling techniques.The result showed that 3%of sodium hypochlorite solution of 18 min was the best disinfection technique to seedless embryo.2.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA had the best adventitious bud induction in seedless watermelon，the differentiation coefficient of adventitious bud was as high as 6.11.0.2 mg·L-1KT could effectively induce adventitious bud to elongate.Scions with 2.5 cm in length which were grated to pumpkin root stocks with flatted cotyledon had the the highest survival rate(84.4%).In the experiment，we suc?cessfully established the system of cotyledon node regeneration and vitro-grafting technology in triploid seedless watermelon.

Seedless watermelon；Triploid；Cotyledon node；Regeneration system；Grafting

2016-05-21；

2016-10-17

湖南省科技廳重點研發項目（2015NK3047）;湖南省科技廳重點研發項目（2016NK2193）;國家公益性行業（農業）科研專項（201503110-03）

閔子揚，男，研究實習員。主要從事葫蘆科蔬菜倍性育種相關研究。E-mail：minziyang1220@163.com

梁志懷，男，研究員。主要從事植物病理學相關研究。E-mail：1178640839@qq.com