抗Galectin-3抗體在皮膚血管炎中的表達

張宇萍 唐增奇 王亮春

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·論著·

抗Galectin-3抗體在皮膚血管炎中的表達

張宇萍 唐增奇 王亮春

目的： 檢測系統性紅斑狼瘡、蕁麻疹性血管炎(UV)、過敏性紫癜(HSP)和變應性皮膚血管炎(LCV)患者血清抗Galectin-3抗體的水平。方法： ELISA法檢測15例伴發皮膚血管炎表現的SLE、13例UV、15例HSP和8例LCV患者血清及15例正常人血清(陰性對照)抗Galectin-3抗體水平。結果： SLE和UV患者血清中抗Galectin-3抗體吸光度值分別為：0.89±0.08、0.71±0.05，顯著高于對照組的0.46±0.02(P<0.05)；HSP和LCV患者中分別為0.60±0.05和0.60±0.04，與正常人相比無明顯差異。結論： 有皮損的蕁麻疹性血管炎及系統性紅斑狼瘡皮膚血管炎可能與血清中抗Galectin-3抗體升高有關。

蕁麻疹性血管炎； 過敏性紫癜； 變應性皮膚血管炎； 抗Galectin-3抗體

皮膚血管炎是一組主要以血管壁腫脹、纖維素樣變性以及血管周圍炎癥細胞浸潤為組織病理特點的疾病，可以局限于皮膚，也可以同時伴發系統性損害。臨床上較常見的類型有蕁麻疹性血管炎(Urticarial Vasculitis，UV)、過敏性紫癜(Henoch-Schonlein Purpura，HSP)、變應性皮膚血管炎(Leukocytoclastic Vasculitis，LCV)；最常見的伴發皮膚血管炎的系統性疾病是系統性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)[1,2]。這幾種皮膚血管炎，血管周圍浸潤細胞都以中性粒細胞為主，病理上統稱為中性粒細胞碎裂性血管炎，目前認為其發病機制與免疫復合物介導的三型變態反應有關。半乳糖凝集素-3(Galectin-3)廣泛存在人體各個組織器官中，作為功能性蛋白，其在腫瘤細胞的增殖分化、粘附遷移以及腫瘤轉移中有重要作用。該蛋白在SLE患者腎臟中也有豐富表達[3]。我們曾研究發現，伴有皮膚血管炎表現的SLE患者血清中抗Galectin-3抗體水平明顯高于健康人，抗體滴度與皮損嚴重程度相關，且隨治療好轉而下降;從SLE患者血清中分離的抗Galectin-3抗體經皮內注射入小鼠體內，可以引起類似于SLE皮膚血管炎的組織病理表現，充分提示該抗體在SLE皮膚血管炎的發生機制中有重要作用[4]。但是，抗Galectin-3抗體是否也與其他常見皮膚血管炎的發生有關還不清楚，因此，本研究主要通過分離和收集伴有皮損的不同類型皮膚血管炎患者的血清，以 ELISA方法檢測其中抗Galectin-3抗體的水平，并初步研究該抗體存在與皮膚血管炎發生之間的關系。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 伴發皮膚血管炎表現的SLE患者血清(陽性對照)15例，正常人血清(陰性對照)15例，有皮損的UV、HSP、LCV患者血清分別為13例、15例、8例。

1.2 主要試劑 Galectin-3蛋白購自Sino Biological公司；HRP標記山羊抗人IgG購自Sigma公司；BSA購自Roche公司；TMB購自湖州英創生物科技有限公司；2M 鹽酸購自汕頭市西隴化工廠有限公司；PBS購自博士德生物工程有限公司；吸光度檢測采用MULTISKAN MK3 ELISA檢測儀。

1.3 主要方法

1.3.1 收集血清 抽取患者及正常人晨起空腹靜脈血4 mL，3000 r/min離心10 min，吸取上層血清，EP管分裝，置于-80℃冰箱保存備用。

1.3.2 ELISA方法檢測樣本血清中的抗Galectin-3抗體水平[4]用PBS將Galectin-3蛋白濃度稀釋至1 μg/mL，在每個聚苯乙烯板的反應孔中加入50 μL蛋白液，4℃條件下孵育過夜；PBST洗5遍，用2% BSA于37℃條件下溫育1h；PBST洗5遍，每孔加入稀釋比為1∶500的血清標本100 μL，37℃溫育1 h；PBST洗5遍，加入濃度為1:3000的HRP-羊抗人IgG，室溫孵育1 h；PBST洗5遍，底物TMB顯色5 min，2M鹽酸終止反應，在ELISA檢測儀上于450 nm處測吸光度(OD值)并記錄。

1.4 統計學方法 用Prism 5統計軟件進行分析。數據采用均數±標準誤表示，用Kruskal-Wallis檢驗進行單因素分析(one-way ANOVA)，各組之間數據多重比較用Dunn's檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SLE患者血清中抗Galectin-3抗體水平 如圖1所示，SLE患者和正常人血清中抗Galectin-3抗體OD值分別為0.89±0.08和0.46±0.02。抗Galectin-3抗體在SLE患者血清中顯著高于健康對照組，且具有統計學差異(P<0.05)。而我們前期實驗檢測抗Galectin-3抗體吸光度值在有皮損SLE患者和正常人分別為：0.75±0.39和0.40±0.32(P<0.05)。此次實驗結果和前期結果一致[4]，一方面進一步肯定了我們之前的發現，另一方面也保證了本次試驗中實驗技術的可靠性。

2.2 UV、HSP、LCV患者血清中抗Galectin-3抗體水平 如圖1所示，UV、HSP、LCV患者血清中抗Galectin-3抗體均高于正常人，OD值分別為：0.71±0.05，0.60±0.05和0.60±0.04，但僅有UV患者血清中抗Galectin-3抗體水平較健康對照組是有統計學差異(P<0.05)。

正常人(15例)；SLE(15例);HSP(15例);UV(13例); LCV(8例); *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

圖1 有皮損的SLE、HSP、UV、LCV患者血清中抗Galectin-3抗體的水平

3 討論

Galectin-3蛋白可表達在細胞核、胞漿或胞膜上，也可以被分泌至循環系統中，具有促進細胞生長、加速細胞周期、調控細胞凋亡以及調節轉錄等功能[5，6]。抗Galectin-3抗體在一些自身免疫性疾病和腫瘤發生過程中有重要作用。在之前的研究中我們發現，有皮膚血管炎表現的SLE患者血清中抗Galectin-3抗體明顯高于正常人，且與皮損嚴重程度呈正相關，提示抗Galectin-3抗體在SLE皮損發生發展中可能起著重要的作用[4]。另外，一些腸道自身免疫性疾病如克羅恩病患者血清中抗Galectin-3抗體滴度也顯著高于正常人，并且與疾病活動性相關[7]。還有，國外也有研究將抗Galectin-3抗體用于治療多發性骨髓瘤及卵巢腫瘤，并取得了不錯的成果，提示該抗體在腫瘤發生中也有重要作用[8]。

在本研究中，我們發現UV患者血清中抗Galectin-3抗體的滴度高于健康對照組，提示血清抗Galectin-3抗體升高不僅見于有皮膚血管炎表現的SLE患者，也可以出現在有皮損的UV患者。眾所周知，SLE發病機制主要是免疫調節失常及外界等因素綜合作用于遺傳易感人群，從而產生大量自身抗體、免疫復合物及炎癥細胞、炎癥因子，導致皮膚、腎臟、肺臟等多臟器損害[9]。在前期研究中，我們還通過體內實驗證實了經皮內注射抗Galectin-3抗體可導致實驗小鼠出現皮膚血管炎的表現[4]。既往研究證實免疫復合物的形成和沉積是導致UV疾病發生發展的重要機制，免疫復合物沉積于血管壁，通過激活補體從而導致局部血管性水腫、缺血、壞死等血管炎性表現，但是參與該病理過程的致病性抗體和靶抗原尚不清楚[10，11]。因此，血清中抗Galectin-3抗體水平升高可能是引起UV患者皮損病變的原因之一，其血清水平升高與蕁麻疹性血管炎的發生、發展以及轉歸之間的關系尚需進一步研究。與此同時，在我們的研究中，伴有皮膚血管炎表現的SLE患者血清中抗Galectin-3抗體滴度較正常人明顯升高，但在UV患者中升高程度并不如前者。Her MY及Roy K等[12，13]的研究也發現，UV中的一部分患者，尤其是伴有低補體表達的患者，在隨訪過程中演變成為SLE，提示外周血中抗Galectin-3抗體明顯升高的UV患者有演變成SLE的趨勢，而HSP、LCV則基本不會演變成SLE，這為我們進一步追蹤UV患者是否會演變至SLE，以及觀察其診斷是否準確、治療是否合適提供了一定的借鑒意義。

值得注意的是，UV、HSP、LCV作為皮膚科三種常見的皮膚血管炎，目前其病因尚不明確。大約有45%～55%的皮膚血管炎患者屬于特發性發病，其他病因主要包括感染(15%～15%)、炎性疾病(15%～20%)、藥物(10%～15%)、腫瘤(<5%)等[14]。而在皮膚病理表現上，這三種皮膚血管炎均可見毛細血管、微靜脈等小血管周圍有大量炎癥細胞浸潤。在臨床工作中，皮膚血管炎診斷的重要依據是臨床及病理表現。如這三種疾病臨床表現不典型，而病理未見明顯改變或機體狀態不允許行皮膚病理活檢，鑒別診斷就成為一個相當困難的問題。在本次研究中我們發現，只有伴有皮損表現的UV患者血清中抗Galectin-3抗體水平明顯高于健康對照組，由此，血清抗Galectin-3抗體可能成為UV的相對特異的生物標志物，有助于UV的診斷。當然，本次試驗的局限性在于，樣本的例數相對較少，期望將來能有更多的患者參與大樣本研究，以充分肯定上述結果。

綜上所述，本研究發現了有皮損的UV患者血清中抗Galectin-3抗體滴度較正常人升高，可能在UV患者發病機制中發揮重要作用。

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(收稿：2017-02-07)

Detection of serum anti-galectin-3 antibody in the patients with cutaneous vasculitis

ZHANGYuping,TANGZengqi,WANGLiangchun.

DepartmentofDermatology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

WANGLiangchun,E-mail:wliangch@mail.sysu.edu.cn

Objective: To detect the level of the serum anti-Galectin-3 antibody in the patients with systemic lupus erythematosus (SLE), urticarial vasculitis (UV), Henoch-Sch?nlein purpura (HSP) and leukocytoclastic vasculitis (LCV). Methods: The level of serum anti-Galectin-3 from 15 patients with SLE, 13 with UV, 15 with HSP, 8 with LCV and 15 healthy controls was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results: The values of optical density (OD) of anti-Galectin-3 antibody in the patients with SLE and UV were 0.89±0.08 and 0.71±0.05 respectively, which were significantly higher than those in the healthy controls (0.46±0.02) (P<0.05). There was no significant difference in the level of anti-Galectin-3 antibody among the patients with HSP (0.60±0.05), LVC (0.60±0.04) and healthy controls. Conclusion: Serum level of anti-Galectin-3 antibody was associated the cutaneous vasculitis in the patients with UV and SLE.

urticarial vasculitis; Henoch-Sch?nlein purpura; leukocytoclastic vasculitis; anti-Galectin-3 antibody

中山大學孫逸仙紀念醫院皮膚科，廣東廣州,510120

王亮春， E-mail: wliangch@mail.sysu.edu.cn