椰子分子標記的研究和應用進展

張璐璐+李靜+吳翼+許麗菁+楊耀東

摘 要 分子標記廣泛應用于科學研究的各個領域。簡要介紹幾種常用的DNA分子標記技術的原理及應用，主要綜述分子技術在椰子種質資源研究的進展，介紹在椰子遺傳多樣性和遺傳關系分析方面的研究狀況，并對其應用前景進行展望。

關鍵詞 椰子 ；分子標記 ；種質資源

中圖分類號 S565.9 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.05.008

Research and Application of Coconut Molecular Markers

ZHANG Lulu1，2） LI Jing2） WU Yi2） XU Lijing2） YANG Yaodong2）

（1 Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070；

2 Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/

Hainan Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， Wenchang， Hainan 571339）

Abstract Molecular markers are widely used in various fields of scientific research. The principle and application of some DNA molecular marker techniques were introduced and the research advances in application of molecular techniques in coconut germplasm were reviewed. The research status of coconut genetic diversity and genetic relationship analysis was discussed， and the application prospects of molecular markers were put forward.

Keywords coconut ； molecular marker ； germplasm resources

椰子（Cocos nucifera L.）是棕櫚科椰子屬中唯一的一個種，為單子葉多年生常綠喬木，經(jīng)濟壽命40～80 a，自然壽命可達100 a以上。椰子在長期的自然選擇和人工選擇中逐漸形成了三種類型，高種椰子、矮種椰子以及介于高種和矮種之間的中間類型。矮種椰子較高種椰子營養(yǎng)生長的時間短，也需4～6年才能開花結果。椰子較長的生長周期給椰子的遺傳育種造成很大困難。目前，我國椰子育種手段落后，育種方法比較單一，依靠常規(guī)育種的方法不但耗時耗力，而且表型性狀受基因型和復雜環(huán)境條件影響，給人工選擇造成許多不確定因素，并且育種周期長、品種更新?lián)Q代慢、優(yōu)良品種少，遠不能滿足農業(yè)生產的需要[1]。

隨著分子生物技術的發(fā)展，分子標記技術廣泛應用于椰子種質資源的研究，分子標記技術提高了遺傳分析的準確性和選育種的有效性，在遺傳育種領域越來越受重視。隨著分子標記研究的深入，目前在遺傳多樣性檢測、品種鑒定、重要性狀的定位、遺傳圖譜的構建、遺傳關系的鑒定及分子標記輔助育種等方面都有一定的研究[2]。本文對幾個分子標記技術以及幾個分子標記研究領域的應用作簡要概述。

1 常見的幾種分子標記

1.1 RFLP

RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）即DNA限制性片段長度多態(tài)性。該技術是根據(jù)酶切位點之間堿基的插入、缺失導致酶切片段大小發(fā)生變化，這種變化通過電泳分離、經(jīng)Southern印跡轉移到硝酸纖維膜上，經(jīng)放射自顯影即可顯示多態(tài)性圖譜[3]。 RFLP為共顯性標記，不受顯隱關系和環(huán)境條件影響，穩(wěn)定可靠，重復性好，可應用于品種鑒定、親緣關系分析、預測雜種優(yōu)勢、基因定位、分子輔助遺傳育種等。但因靈敏度不高、操作繁瑣、步驟繁雜、檢測周期長、成本高等原因限制了RFLP技術的應用[4]。

1.2 RAPD

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）即隨機擴增多態(tài)性DNA，是以單個人工合成的隨機多態(tài)性核苷酸序列為引物，擴增產物經(jīng)凝膠電泳和放射自顯影來檢測[5]。該技術在設計引物時不需知道引物序列信息、操作簡單快捷、通用性強、靈敏度高、操作安全，但此技術易受外界影響、穩(wěn)定性及重復性較差、易產生假帶，且為顯性標記，不能區(qū)分雜合體和純合體。RAPD可對整個基因組DNA進行多態(tài)性檢測，廣泛應用于動植物種系品種鑒定、遺傳多樣性分析、連鎖圖的構建等。

1.3 AFLP

AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphic）即擴增片段長度多態(tài)性，是RFLP和RAPD技術相結合的產物。擴增產物經(jīng)放射性同位素標記銀染、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，根據(jù)凝膠上的DNA指紋檢測多態(tài)性。該技術既有RFLP技術的可靠性，又有RAPD技術的高效性，能穩(wěn)定、快速、準確的檢測基因組DNA的差異，不需預先知道DNA序列[6]。AFLP主要應用于種質資源的鑒定和保存、基因表達和調控研究、輔助選擇育種、指紋圖譜的分析構建和目標性狀基因連鎖圖構建等。

1.4 SSR

SSR（Simple Sequence Repeat）即簡單重復序列，又稱微衛(wèi)星（microsatellite），是含少數(shù)幾個堿基對的短串聯(lián)重復序列，隨機廣泛分布于真核生物基因組中，不同的遺傳材料由于重復次數(shù)的不同而產生多態(tài)性。SSR具有標記數(shù)量多、DNA用量少、操作簡便、多態(tài)性高、重復性好等優(yōu)點，能夠準確高效的鑒別大量的等位基因，但必須對其兩端序列測序才能設計出相應的引物，引物具有高度的種屬特異性，開發(fā)成本較高[7]。已廣泛應用于遺傳多樣性研究、品種鑒定、基因定位、指紋圖譜構建和分子標記輔助選擇育種等多個方面。

2 分子標記在椰子研究中的應用

2.1 種質資源遺傳關系分析

分子標記是檢測種質資源遺傳多樣性的有效工具，分子水平的數(shù)據(jù)可以反映物種的系統(tǒng)演化、物種與品種的親緣關系和分類，比傳統(tǒng)的方法更能反映物種間的遺傳多樣性。

Sankaran和Damodaran等[8]利用RAPD標記法從45個隨機引物中選取13個表達引物，對30個椰子品種進行遺傳分析，獲得的多態(tài)性基因型與選定的多態(tài)RAPD標記顯示不同的變異為67.33%，13個引物的平均多態(tài)信息含量（PIC）值是0.29，最大和最小值是0.46和0.17，引物分別是OPF-19和OPH-25，RAPD分析得到的結果和早期研究結果一致。用UPGMA聚類分析法將這些椰子進行聚類分析得到2個集群，第一個集群包含一個矮種WCGC 08，第二個集群包含其余29個椰子品種，結果表明，集群模式?jīng)]有任何地理的親和力。

Baudouin等[9]利用30個SSR標記對11個地區(qū)的椰子進行基因型分析，這些椰子來源于1 215個椰子中的104個巴拿馬高種，選擇沒有被遺傳污染的54個椰子，還有其中的80個高種椰子共來自11個地區(qū)，通過得到的微衛(wèi)星位點，用Geneclass 2軟件分析得到相似指數(shù)，菲律賓與巴拿馬椰子相似系數(shù)最高，與波利尼西亞相似系數(shù)最小，比較分析波利尼西亞和菲律賓30個位點的相似系數(shù)，三分之一的位點相對于巴拿馬高種菲律賓有較高的基因頻率，波利尼西亞缺失或罕見。對于其它地區(qū)，墨西哥的相似系數(shù)接近菲律賓，基于遺傳相似性墨西哥起源將會是一個合理的替代，但歷史因素表明，墨西哥椰子和巴拿馬椰子之間的遺傳關系源于他們的共同祖先菲律賓椰子。

肖勇和羅意等開發(fā)了來自Illumina公司轉錄組序列數(shù)據(jù)的30個新的微衛(wèi)星標記，并應用這些標記的遺傳多樣性評估了12個來自中國和18個來自東南亞的椰子品種。微衛(wèi)星標記在群體中顯示由低到高的遺傳多態(tài)性，觀察到的雜合性變化從0.06到0.79 ，平均為0.39±0.15。研究結果表明，東南亞群體的等位基因數(shù)量顯著增加（p= 0.02），但相比來自中國的品種觀察到的雜合性（p =0.08）或香農多樣性指數(shù)評分（p=0.12）差異性不明顯（p<0.05）。種群結構分析表明，中國椰子與東南亞椰子種質資源的一個子群類似，這表明中國椰子沒有獨立發(fā)展的東南亞種群。結合種群結構分析和歷史信息，設計了一個可能的解釋為從東南亞到中國椰子的傳播模式：海洋洋流可能攜帶椰子到海南，而云南省椰子可能是來自東南亞人類傳播[10]。

Manimekalai等[11]利用19個引物產生的199個ISSR標記對從全球椰子在國際資源庫收藏的29個高種、2個中間型、2個矮種共 33個椰子進行分析，其中154個標記具有多態(tài)性（77%）。33個椰子的199個ISSR標記相似系數(shù)范圍是0.526到0.855，平均為0.674。33個椰子品種可以形成528對組合，尼日利亞高（NIT）和巴拿馬高（PNT）相似性指數(shù)最高（0.855），而chowghat橙色矮種（COD）和尼科巴高（NICT01）相似性指數(shù)最低（0.526）。在東南亞平均一對相似性指數(shù)達到0.737，南太平洋南亞和大西洋分別0.687和0.638。系統(tǒng)樹圖顯示聚集為六個集群，大部分高種集中在3個集群。系統(tǒng)樹圖和主坐標圖顯示，東南亞椰、南亞椰和南太平洋椰形成獨立的分組，這些分組和通常椰子從其起源的中心的傳播模式一致。

2.2 分子標記輔助育種

分子標記輔助育種即通過對椰子重要性狀的分子標記的研究，篩選出與性狀緊密連鎖的遺傳標記，對目標基因實施間接選擇，在早代進行準確、穩(wěn)定的選擇，可提高選擇的準確性和育種效率。

人工授粉是使用國際椰子資源庫的老化椰子再生，這個過程的有效性尚未評估。Saraka等[12]使用15個SSR標記對三個高種椰子，莫桑比克高種（MZT）、加澤爾半島高種（GPT）和塔希提島高種（THT） 再生（G1）和父母（G0）之間的相似之處進行分析。15個SSR引物產生123個等位基因，平均基因多態(tài)性為0.734，在再生的基因多樣性相對減少，它從0.690下降到0.587，但是發(fā)現(xiàn)高種椰子再生和父母之間Jaccard相異指數(shù)較低，從0.072到0.133不等。記錄下來G0-G1高種椰子的遺傳多樣性值較低（DST），從0.005到0.007，世代和高種椰子之間的平均基因岐異值為0.11，范圍是0.072～0.133。因此，對基因庫使用控制授粉技術的再生方法可有效滿足保護登記入冊的原始椰子的遺傳完整性。

Yaima等[13]對科特迪瓦大烏拉地區(qū)出現(xiàn)的椰子樹致死性黃化病癥狀和感染植原體進一步測試植原體病原體16srRNA基因的特征分析。測試17個椰子中7個有癥狀的嵌套PCR植原體普遍存在致死性黃化病，特異性引物擴增影響產品的預期大小，而未受感染的無癥狀的植物無任何DNA擴增。檢測到大烏拉椰子樹（KC999037）感染的科特迪瓦致死性黃化病植原的16srDNA序列與加納16SrXXII群組的致死性黃化病植原體有99%的序列有一致性。16srDNA的虛擬和實際基礎序列RFLP和系統(tǒng)發(fā)育分析表明在大烏拉的植原體與科特迪瓦致死性黃化病被命名為16SrXXII-B，是組群16SrXXII的新子群。目前的結果支持先前疾病是從鄰國加納傳播到科特迪瓦的懷疑，可能對大烏拉地區(qū)的椰子樹的生存和象牙海岸的椰子產業(yè)構成威脅。

2.3 遺傳多樣性分析

不同的DNA標記系統(tǒng)已經(jīng)用于評估椰子的遺傳多樣性，分子標記產物的多態(tài)性可以反映測試材料的多樣性，為種質資源的研究提供了方便。

Rajesh等[14]利用一個簡單新穎的標記系統(tǒng)以其密碼子多態(tài)性（SCoT）來評估椰子，作為一個潛在的標記系統(tǒng)。用SCoT標記評估23個代表不同的地理區(qū)域的椰子（10個高種和13個矮種）的遺傳多樣性。從25個SCoT引物中篩選了15個引物進行下一步研究，得到102 個記錄片段，其中87.2%具有多態(tài)性，用軟件NTSYS-pc2.0分析數(shù)據(jù)，相似系數(shù)值介于0.37（CCNT和KTOD）和0.91（MYD和MOD）之間。用UPGMA法構建系統(tǒng)樹圖，得到2個集群，高種和矮種椰子的劃分很明顯，一般來說，椰子在同一地理區(qū)域的聚集在一起。根據(jù)SCoT觀察分析椰子遺傳多樣性與早些時候使用其它標記系統(tǒng)的結果相差無幾。

Margarita等[15]利用Meerow等[16]先前研究的15個 SSR標記分析8個椰子品種得到的大西洋高種和巴拿馬高種兩個高種的異型雜交，增加馬來矮種和巴拿馬高種的雜交種和一種未知椰子，利用28個分子標記和之前的15個分子標記分析對由218個基因型組成的10個椰子品種進行遺傳分析。結果表明，每個位點上等位基因數(shù)范圍從2～14，而平均基因多樣性從0.035到0.546不等。多態(tài)信息含量（PIC）值的范圍從0.091到0.838，平均為0.531，在每個品種的基礎上平均等位基因豐富度范圍從1.01到1.90。用2種聚類方法NJ 和UPGMA生成系統(tǒng)樹圖，結果有一致的分組也有顯著的差異，使用2種聚類分析方法解決品種的對比關系，研究結果影響當前椰子馴化和未來評估不同品種之間的遺傳關系。

Lebrun[17]通過對倫內爾島的一個隔離后代的高種進行重量和比率QTL分析，得到了控制椰子果實組分的遺傳因素。這個群體在先前Lebrun[17]等的研究中已經(jīng)建立基礎連鎖圖，以及對QTL分析的果實產量。新添加的53個的標記（主要是SSRs）完善了連鎖圖。11個性狀研究共鑒定了52個QTLs，它們中的34個分別聚集在6個集群，這可能符合單基因多效性。一些添加的QTLs位點除了聚集在這些集群，也對個體性狀有相對較大的影響。連鎖圖譜總共有290個隔離標記（80個SSR， 8個E. guineensis標記，6個RFLP和204個AFLP標記）。如上所述，由作圖群體的RIT親本建立連鎖圖16個連鎖群。連鎖圖的總長度是1849.8 cM，連鎖圖長度從51.9 cM到181.8 cM不等。總共有274個標記位于更新連鎖圖上（比先前Lebrun的2001年連鎖圖多47個）。每個連鎖群標記的數(shù)量在6～28，連鎖群之間的平均密度3.3 和13.8 cM。另外發(fā)現(xiàn)，果實的主要組分的重量、胚乳濕度和果實產量位于基因組中的不同位置，這表明可以通過選擇QTLs的獨立部分獲得有效的分子標記輔助選擇收益率。已知的太平洋和大西洋中椰子分子和表型差異，可以調查研究這些分組之間雜交的椰子遺傳多樣性[18]。

3 分子標記在椰子研究領域的應用前景

椰子雖為熱帶地區(qū)重要的作物之一，但是分子標記在椰子種質資源和育種研究中還未得到廣泛的應用。分子標記對于品種鑒定與分類、種質資源的保護、親緣關系、輔助選擇育種、分子連鎖圖譜構建等方面都有著十分重要的意義，為傳統(tǒng)的育種提供了一種有力的輔助手段。我國椰子育種工作目前應加快種質資源的收集以及對椰子的遺傳資源的研究，大力推廣優(yōu)質高產品種，積極引入高產高效外來資源，尤其可以作為母本雜交種的矮種，來滿足目前和將來的育種需要，充分的利用分子標記技術與常規(guī)育種技術相結合，還應注意尋找新型分子標記，尋找低成本的簡化分子標記技術，改進分析基因組的方法和技術。相信隨著分子標記技術的日臻完善，分子標記必將在椰子育種中發(fā)揮重要的作用，有利于椰子產業(yè)的發(fā)展，為椰子產業(yè)帶來經(jīng)濟效益，滿足人們對椰子產品生產和生活的需求。

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