BMPR—IB基因多態性與湖羊產羔性能的關系

楊媛 翁愷麒 李擁軍 顧祝榮 郭海燕

摘要[目的]研究骨形態發生蛋白受體IB（Bone morphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB）基因多態性與湖羊產羔性能的關系。[方法]采用PCR擴增、酶切和序列測定等方法對湖羊BMPR-IB基因型進行鑒定，并分析BMPR-IB基因型與湖羊產羔數的關系。[結果]共檢測出3種基因型，并將其分別定義為AA、AG、GG。測序結果表明，等位基因A與G相比發生了1處堿基突變（A746G）。BMPR-IB基因在湖羊中存在多態性（AA、AG和GG）；湖羊中A等位基因的頻率為0.032，G等位基因的頻率為0.968。AA、AG和GG基因型頻率分別為0.006、0.053和0.941。AA、AG和GG基因型湖羊的平均產羔數分別為1.25、1.81和1.96。[結論]BMPR-IB基因可能是湖羊多胎性能的主效基因，可用于對湖羊產羔數的選擇。

關鍵詞湖羊；BMPR-IB基因；產羔數

中圖分類號S826文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）26-0113-03

Relationship between Polymorphism of BMPRIB Gene and Lambing Performance of Hu Sheep

YANG Yuan， WENG Kaiqi， LI Yongjun* et al

（College of Animal Science and Technology， Yangzhou University/Key Laboratory for Animal Genetic， Breeding， Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract[Objective]To study the relationship between the polymorphism of bone morphogenetic protein receptor IB（BMPRIB） gene and the lambing performance of Hu Sheep.[Method] The genotypes of BMPRIB gene was identified by the methods of PCR amplification，enzyme digestion and sequencing.And the relationship between the genotypes of BMPRIB and litter size of Hu Sheep was analyzed.[Result]Three genotypes were detected， and defined as AA， AG， GG， respectively. The sequencing results showed that the allele A and G had a base mutation （A746G）， and there was BMPRIB genes polymorphism （AA， AG and GG） in Hu Sheep. The frequency of A allele in Hu Sheep was 0032， the frequency of G allele was 0.968. The frequencies of AA，AG and GG genotype were 0.006， 0.053 and 0.941，respectively. The average litter size of Hu Sheep with AA， AG and GG genotypes were 1.25， 1.81 and 1.96，respectively. [Conclusion]BMPRIB gene might be the major gene for the prolificacy of Hu Sheep， it could be used to select litter size of Hu Sheep.

Key wordsHu Sheep；BMPRIB gene；Litter size

我國綿羊的遺傳資源和飼養數量均位居世界第一，但出欄率僅19.6%，與世界平均水平（35%）相比明顯偏低[1-2]。湖羊主要分布在江浙一帶，是我國著名的一級保護多胎品種。湖羊具有終年發情的特點，且性成熟較早，一年內可以完成出生、配種、產羔，產羔率能達到200%～250%[3-4]。湖羊的繁殖性狀是其主要的經濟性狀之一，這一性狀是由多基因控制，因此尋找控制繁殖性狀的主效基因對于提高其經濟性狀具有重要意義。隨著現代分子標記輔助選擇技術的發展和應用，湖羊繁殖性狀的遺傳改良有了新的方向和途徑。

早在1980年就有研究表明綿羊的多胎性是由控制繁殖性狀的基因發生突變所導致的，并將該突變基因初步命名為FecB，該基因的功能是通過增加排卵數而提高產仔數[5-6]。骨形態發生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）是轉化生長因子（Transforming growth factor，TGF）超家族中最大的亞家族，它們具有多功能性，且在動物機體的各組織器官廣泛分布，參與動物的免疫系統、胚胎發育和生殖發育，對哺乳動物的繁殖有著非常重要的影響[7-11]。BMPR-IB基因對子宮內膜的發育有著直接或間接作用[12]。BMPR-IB基因是由可編碼502個氨基酸的10個外顯子組成，其編碼序列長1 509 bp[13]，該基因在骨骼肌、腦和腎臟中有中度表達，最重要的是在與綿羊繁殖有關的各器官（如卵巢、子宮、睪丸和前列腺）中都有廣泛表達[14]。研究表明，控制多胎性能的基因是對應于人染色體4q22～23區間的6號常染色體BMPR-IB基因，該基因的1對等位基因A與G相比發生了1處堿基突變（A746G），使攜帶BMPR-IB突變基因母羊的顆粒細胞分化加快，卵泡成熟加速，進而使排卵數增多[15-16]。此外，一些研究表明Booroola母羊高繁殖力與該突變完全相關[17-20]。筆者研究了湖羊BMPR-IB基因的多態性及其與產羔數的關系，旨在為篩選湖羊多胎性候選基因提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗動物

選取具有第1胎和第2胎生產記錄的湖羊，共342只。采集湖羊頸靜脈血液約3 mL，并記錄耳標號，羊只全部來自于江蘇省太倉金倉湖羊場。采血用一次性采血盛血器，并且提前在采血管中加入ACD抗凝劑。血樣用冰盒帶回實驗室后4 ℃下保存，以備提取DNA。

1.2DNA的提取及檢測

參照天根生化科技（北京）有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒說明書來提取DNA，-20 ℃下保存。

1.3PCR擴增與酶切

1.3.1PCR擴增。

BMPR-IB引物采用Primer5-blast設計引物的方法，由鉑尚生物技術（上海）有限公司合成，引物序列為：

上游引物為5′-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3′；

下游引物為5′-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3′。

PCR反應體系（25 μL）包括DNA 1 μg、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR MasterMix（天根生化科技有限公司）12.5 μL，用ddH2O補至25 μL。PCR反應程序如下：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，57 ℃復性90 s，72 ℃延伸1 min，34個循環；72 ℃終延伸7 min。將PCR擴增產物進行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2

酶切。用AvaⅡ限制性核酸內切酶進行酶切，酶切體系為20 μL，其中擴增產物為5 μL，限制性內切酶10 U，37 ℃水浴3 h；酶切反應結束后，將20 μL消化液全部加樣于2.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結束后在紫外凝膠成像系統中照相，根據酶切產生的條帶確定基因型。

1.4序列測定

將提取的DNA送至無錫翼和應用生物技術有限公司進行測序及基因型鑒定。

1.5數據統計與分析

收集并整理湖羊的生產記錄，計算湖羊BMPR-IB不同基因型及基因頻率。使用SPSS 22.0統計軟件對試驗數據進行統計與分析，對不同BMPR-IB基因型的湖羊產羔數進行LSD多重比較，分析不同基因型與產羔數之間的關系。

2結果與分析

2.1PCR擴增結果

從342個樣品PCR產物中隨機抽出9個PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測，結果表明其特異性良好（圖1），目的條帶長度符合預期，在140 bp左右。

2.2湖羊BMPR-IB基因酶切結果

由于湖羊BMPR-IB基因的1對等位基因A與G相比發生了1處堿基突變（A746G），因此對湖羊BMPR-IB基因經酶切后進行擴增，將擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測，得到110和140 bp 2種帶型（圖2）。在所檢測的羊群中共有3種基因型，設與PCR原液條帶相同的個體為AA基因型，同時含有110和140 bp條帶的個體為AG基因型，只含有110 bp條帶的個體為GG基因型。

2.3不同基因型測序結果

為確定BMPR-IB基因的突變位點，將AA、AG與GG基因型的PCR產物送交無錫翼和應用生物技術有限公司進行測序。測序結果表明，等位基因A與G相比發生了1處堿基突變（A746G）。測序結果如圖3所示。

2.4湖羊BMPR-IB基因型及基因頻率

檢測結果表明，在342個湖羊樣本中，2個為AA型，18個為AG型，322個為GG型。經計算，等位基因G和等位基因A的基因頻率分別為0.968和0.032。AA、AG和GG基因型頻率分別為0.006、0.053和0.941，湖羊AA、AG和GG基因型的平均產羔數分別為1.25、1.81和1.96。

2.5湖羊BMPR-IB基因的不同基因型產羔數比較

由表1可知，AA、AG、GG基因型第1胎產羔數差異顯著（P<005）；AA與AG、GG基因型第2胎產羔數差異顯著（P<005），但GG基因型與AG基因型間差異不顯著（P≥005）。整體來看，AA與AG、GG基因型的產羔數差異顯著（P<005），GG與AG基因型產羔數間差異不顯著（P≥0.05）。

3討論與結論

綿羊作為經濟動物，為人們提供肉和毛皮。隨著社會的發展，其產量已不能滿足人類的需求，主要是因為綿羊為單胎短日照動物，生產力低下，嚴重限制了綿羊業的發展。湖羊作為我國特有的多胎品種，研究其多胎機制對于綿羊業的發展具有重要作用。

很早以前，育種學家便開始關注湖羊的多胎性，許多學者通過研究湖羊的內分泌機制和表型特點，對其選育進行指導，明顯提高了湖羊的產羔率。管峰等[21]對湖羊的BMPR-IB基因進行多態性檢測發現，該湖羊群體中只檢測出 BB基因，因而在湖羊中的基因效應完全一致，所以認為BMPR-IB基因不是湖羊多胎的主效基因，對該湖羊群體進行選育后仍然可以提高其產羔率。閆亞東等[19]認為湖羊BMPR-IB基因與其他單胎品種差異顯著，所以BMPR-IB基因是導致湖羊多胎性狀的主效基因。

該試驗的樣本數為342個，將全部樣本送交無錫冀和應用生物技術有限公司測序鑒定基因型，結果發現AA、AG和GG基因型頻率分別為0.006、0.053和0.941。對BMPR-IB與湖羊產羔數的關系進行了分析，結果發現AA、AG和GG基因型之間的產羔數存在顯著差異，這與吳麗麗等[22]的研究結果相一致，但與管峰等[21]的研究結果不一致，這可能是由于參照對象不同。該試驗結果表明，BMPR-IB基因可能是湖羊多胎性能的主效基因，可用于對湖羊產羔數的選擇。

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45卷26期楊 媛等BMPR-IB基因多態性與湖羊產羔性能的關系