大孔樹脂純化紅蕓豆種皮花色苷

郝瑞林 譚午芳 董倩倩 范建鳳

摘要[目的]研究大孔樹脂柱層析法純化紅蕓豆種皮花色苷的條件并對純化產(chǎn)物進行高效液相色譜（HPLC）分析。[方法]通過靜態(tài)吸附和解吸試驗比較了AB-8、D101、SP825、NKA-9、XAD-16和HPD100這6種不同類型大孔樹脂對紅蕓豆種皮花色苷的吸附和洗脫性能，優(yōu)化了AB-8樹脂純化紅蕓豆種皮花色苷的工藝，HPLC對比分析純化產(chǎn)物與粗提物。[結果]AB-8大孔樹脂對紅蕓豆種皮花色苷吸附和洗脫性能較好，最佳上樣流速為3.0 BV/h。最佳洗脫條件為pH 1.0、100%乙醇作為洗脫液，洗脫流速為4.5 BV/h，得到的花色苷純度達86.05%。HPLC檢測結果表明純化效果明顯。[結論]AB-8大孔樹脂可有效分離紅蕓豆種皮花色苷。

關鍵詞紅蕓豆；花色苷；大孔樹脂；純化；HPLC

中圖分類號TS264.4文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）26-0011-04

Purification of Anthocyanins from Seed Coat of Red Kidney Bean （Phaseolus vulgaris L.） by Macroporous Adsorption Resin

HAO Ruilin1，TAN Wufang1，DONG Qianqian1，F(xiàn)AN Jianfeng2*（1.Department of Biology，Xinzhou Teachers University，Xinzhou，Shanxi 034000；2.Department of Chemistry，Xinzhou Teachers University，Xinzhou，Shanxi 034000）

Abstract[Objective] The aim was to study purification of anthocyanins from seed coat of red kidney bean by macroporous adsorption resin.[Method] The static adsorption and desorption characteristics of macroporous adsorption resins including AB8，D101，SP825，NKA9，XAD16 and HPD100 for anthocyanins were investigated and the purification technology of anthocyanins by AB8 macroporou adsorption resin were optimized.And the HPLC technology were applied to analyze the purified.[Result] Resin AB8 showed a satisfactory adsorptiondesorption capacity for purification of anthocyanins from seed coat of red kidney bean.The optimized purification condition as the flow rate of adsorption solution was 3.0 BV/h，and the optimized desorption solution was 100% ethanol （modified to pH 1.0 by hydrochloric acid） with the flow rate of 4.5 BV/h.The purified powder owned a purity of 86.05% and HPLC method proved the purification was effective.[Conclusion] The developed method can be applied to the purification of anthocyanins from seed coat of red kidney bean.

Key wordsRed kidney bean；Anthocyanins；Mmacroporou adsorption resin；Purification；HPLC

花色苷屬黃酮類化合物，主要分布在植物表皮細胞的液泡中，是植物呈現(xiàn)藍色、紫色、紅色和黃色的主要原因[1-2]。目前已有超過500種天然花色苷被發(fā)現(xiàn)，其基本構成苷元為矢車菊色素、天竺葵色素、飛燕草色素、芍藥色素、矮牽牛色素、錦葵色素[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)花色苷具有抗氧化、抗腫瘤、修復胰島組織損傷等生理功效，在心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病等的預防和治療領域有廣泛的應用前景[5]。紅蕓豆（Phaseolus vulgaris L.）屬蝶形花科菜豆屬，色澤鮮艷且含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素及鈣、鐵、鎂等微量元素[6]。大孔樹脂柱層析是目前從植物粗提物中分離、精制黃酮類化合物時應用最廣泛的技術，具有吸附容量大、分離速度快、再生簡便、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點[7]。筆者對應用大孔樹脂柱層析初步純化紅蕓豆種皮中花色苷的條件進行了研究，旨在為紅蕓豆的開發(fā)利用和深加工提供參考。

1材料與方法

1.1材料紅蕓豆購自岢嵐縣農(nóng)貿(mào)市場。JY92-IIDN超聲波細胞破碎儀購自江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；UV-2250紫外可見光譜儀購自日本島津公司；SH2-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自河南省鞏義市予華儀器有限公司；DZF-6050真空干燥箱購自上海龍躍儀器設備有限公司；SCIENTZ-10N低溫冷凍干燥機購自浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；BS-100A 自動部分收集器、BT-100恒流泵購自上海瀘西分析儀器廠有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀購自日本島津公司。AB-8、D101、NKA-9購于天津市光復精細化工研究所，其余樹脂購于上海摩速科學器材有限公司。

1.2方法

1.2.1紅蕓豆種皮花色苷的提取。

紅蕓豆篩選洗凈后剝皮，將紅蕓豆皮在30 ℃、0.05 MPa條件下真空干燥后粉碎，過60目篩，經(jīng)單因素試驗和響應面優(yōu)化設計，確定以40%乙醇（濃鹽酸調(diào)pH 1.0）為提取劑，料液比1∶24，68 ℃、160 W超聲波輔助提取78 min時，花色苷得率最大為1 855.70 g/kg。將粗提液4 000 r/min、20 min離心后取上清，50 ℃減壓蒸發(fā)除去乙醇后得到花色苷含量為50.27 mg/L的提取液，置于 4 ℃冰箱備用。

1.2.2花色苷濃度測定。

pH示差法測定花色苷得率[8]：紅蕓豆種皮花色苷濃度以矢車菊素-3-葡萄糖苷計，取2 mL上清液用pH 1.0、0.025 mol/L氯化鉀緩沖液稀釋至25 mL，另取2 mL上清液用pH 4.5、0.4 mol/L醋酸鈉緩沖液稀釋至25 mL。分別測定稀釋液517、700 nm波長處吸光值，記作A517與A700。按公式（1）計算花色苷濃度：

C=A×449.2×1 000×DF26 900（1）

式（1）中，C為花色苷質(zhì)量濃度（mg/L）；A=（A525-A700）pH 1.0-（A525-A700）pH 4.5；449.2為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子量；DF為稀釋倍數(shù)；26 900為摩爾消光系數(shù)。

1.2.3樹脂的預處理與再生。

將樹脂用2倍體積無水乙醇浸泡24 h，待樹脂充分溶脹后裝柱，無水乙醇洗至流出液不再渾濁，蒸餾水洗脫至無乙醇味，浸于蒸餾水中備用[9]。

1.2.4樹脂的篩選。

分別取處理好的樹脂各1 g置于錐形瓶，加入花色苷濃度為50.27 mg/L的粗提液100 mL，封口，置于25 ℃水浴恒溫振蕩器，100 r/min 振蕩吸附12 h后測定溶液中花色苷含量。吸附飽和后，過濾樹脂除去殘留花色苷，加入100 mL 60%乙醇溶液（鹽酸調(diào)pH為1.0），25 ℃、100 r/min 振蕩解吸附，定時從上清液取樣，測定上清中花色苷質(zhì)量濃度，按照公式（2）和（3）計算樹脂的吸附量與解吸率，重復試驗3次。

靜態(tài)吸附量（mg/g）=（C0-C1）/10 （2）

靜態(tài)解吸率=（C0-C1）/C2×100% （3）

式（2）、（3）中，C0為提取液花色苷的初始濃度（mg/L）；C1為吸附平衡后的溶液中花色苷濃度（mg/L）；C2為解吸液花色苷濃度（mg/L）。

1.2.5AB-8樹脂對紅蕓豆種皮花色苷的靜態(tài)吸附動力學。

稱取處理好的AB-8大孔樹脂1 g，置于錐形瓶中，加入濃度為50.27 mg/L的紅蕓豆種皮花色苷粗提液100 mL，置于25 ℃水浴恒溫振蕩器，100 r/min振蕩吸附，分別在15、30、45、60、120、180、240、300 min時取樣，按公式（2）計算吸附量，并繪制AB-8大孔樹脂對紅蕓豆種皮花色苷的吸附動力學曲線[10]。

1.2.6動態(tài)吸附條件選擇。

在Ф1.0 cm×50.0 cm玻璃柱中裝入處理好的AB-8樹脂至柱高為12.7 cm（約10 mL），紅蕓豆花色苷提取液以不同流速上樣至吸附飽和，每隔一定時間收集流出液，按公式（1）計算每份流出液花色苷質(zhì)量濃度及合并后的流出液中花色苷的濃度，繪制動態(tài)吸附曲線，按公式（4）計算動態(tài)吸附量，并以上樣流速對動態(tài)吸附量作圖[11]。

動態(tài)吸附量（mg/mL）=（Cs-C3總）×Vs/10 000 （4）

式（4）中， Cs為上樣液中花色苷含量（mg/L）；C3總為合并后流出液中花色苷含量（mg/L）；Vs為上樣液體積（mL）。

1.2.7動態(tài)解吸附條件選擇。

在Ф1.0 cm×50.0 cm玻璃柱中裝入動態(tài)吸附飽和的AB-8樹脂至柱高為12.7 cm（約10 mL）。分別用不同體積分數(shù)的乙醇溶液（濃鹽酸調(diào)pH為1.0）以3.0 BV/h的流速洗脫8 BV，考察洗脫液中乙醇濃度對解吸效果的影響；用60%乙醇（濃鹽酸調(diào)pH為1.0）以不同的流速洗脫8 BV，考察洗脫流速對解吸效果的影響。每隔一定時間收集洗脫液，測定每份洗脫液中花色苷質(zhì)量濃度及合并后洗脫液中花色苷質(zhì)量濃度，繪制動態(tài)解吸曲線，按照公式（5）計算動態(tài)解吸率并分別以乙醇體積分數(shù)及洗脫流速對動態(tài)解吸率作圖[12]。

動態(tài)解吸率=C4總V4（Cs-C3總）Vs×100%（5）

式（5）中， C4總為合并后洗脫液中花色苷含量（mg/L）；V4為洗脫液總體積（mL）。

1.2.8純化產(chǎn)物純度的測定。

經(jīng)大孔樹脂柱層析純化后，花色苷洗脫液30 ℃減壓濃縮，凍干成粉。稱取20 mg花色苷粉末，用pH 1.0甲醇溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中，利用pH示差法測定該溶液的花色苷濃度，用公式（6）計算產(chǎn)物純度[13]。

產(chǎn)物純度=C/200×100% （6）

式（6）中，C為測定花色苷質(zhì)量濃度（mg/L）。

1.2.9 HPLC檢測條件。

參考Jampani 等[14]的方法并稍作修改，采用Wondasil C18柱（250 nm×4.6 mm，5 μm），檢測溫度25 ℃，流速1 mL/min，進樣體積20 μL，A相為5%甲酸水溶液，B相乙腈，檢測波長為525 nm，洗脫條件：0～5 min，5% B；5～12 min，5%～12% B；12～20 min，12%～18% B；20～70 min，18%～70% B；70～80 min，70% B；80～85 min，70%～100% B；85.01 min，5% B。

1.3數(shù)據(jù)處理試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件作圖，利用Design-Expert 8.0.6進行方差分析。

2結果與分析

2.1紅蕓豆種皮花色苷乙醇提取液最大吸收波長的確定

圖1為紅蕓豆種皮花色苷提取液（pH=1.0，含40%乙醇）在400～700 nm波長處的吸收光譜。由圖1可見，用酸性乙醇提取的紅蕓豆種皮花色苷溶液在可見光區(qū)最大吸收波長λmax為517 nm。

2.2紅蕓豆種皮花色苷純化工藝研究

花色苷粗提取液中通常包含有大量的多糖、有機酸、礦物質(zhì)及其他的水溶性雜質(zhì)[15]。大孔樹脂理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水、酸、堿及甲醇、乙醇等常用有機溶劑。樹脂內(nèi)部分布有網(wǎng)狀孔穴，因而具有較高的比表面積和吸附能力。同時，樹脂合成時通過引入酰胺基、酚羥基等極性基團從而使樹脂具有極性化合物吸附能力進而具備較強的分離能力。常用于花色苷類物質(zhì)純化的大孔樹脂有AB-8、HP-20、NKA-9、HPD-700、D-101等[16-20]。

2.2.1樹脂吸附性能的比較。

由圖2（A）可見，AB-8樹脂對紅蕓豆種皮花色苷吸附能力最強，12 h吸附量為0.63 mg/g，其次為D101和XAD-16樹脂。由圖2（B）可見，采用pH 1.0、60%乙醇洗脫時， AB-8樹脂的解吸率最高達92.11%，且解吸速率快，3 h解吸率達90%。XAD-16樹脂解吸率最低，9 h解吸率為63.43%。綜合靜態(tài)吸附和解吸試驗結果，選擇AB-8樹脂作為紅蕓豆種皮花色苷純化介質(zhì)。

2.2.2AB-8大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線。

由圖3可見，在1 h內(nèi)，AB-8樹脂對紅蕓豆種皮花色苷的吸附量隨時間的延長而快速增加，1 h時吸附量達0.51 mg/g，超過1 h后，吸附速率下降，3 h時逐漸達到吸附平衡，之后隨著時間的延長，吸附量緩慢增加。

2.2.3上樣流速對吸附效果的影響。

由圖4可見，上樣流速越快，泄漏越快，吸附量越小，吸附效果越差。以9 BV/h的流速上樣時，15 min即可達到吸附飽和，但AB-8樹脂對紅蕓豆種皮花色苷的吸附量只有0.29 mg/g，以3 BV/h的流速上樣時，達到吸附飽和需要45 min，吸附量達0.59 mg/g，因此選擇3.0 BV/h為最佳上樣流速。

2.2.5洗脫速率對解吸效果的影響。

由圖6可見，當洗脫體積達到8.0 BV時，9.0 BV/h流速下洗脫速度最快，40 min洗脫完成。1.5 BV/h洗脫速度最慢，300 min才洗脫完成。由圖7可見，解吸率隨洗脫流速的增加呈先增大后降低的趨勢，當流速為4.5 BV/h時解吸率最大為81.41%。綜合分析選擇4.5 BV/h為最佳洗脫流速，最小洗脫劑量為6.0 BV。

2.2.6花色苷純度。

紅蕓豆種皮花色苷提取液經(jīng)AB-8大孔樹脂柱層析純化后，經(jīng)30 ℃減壓濃縮除去乙醇，再經(jīng)冷凍干燥后成為暗紅色粉末，經(jīng)檢測其純度達86.05%。

2.3純化產(chǎn)物的HPLC分析

由圖8可見，該試驗條件下粗提物有6個主要組分峰。由圖9可見，純化產(chǎn)物有3個主要組分峰。圖8與圖9對比可知，經(jīng)過AB-8大孔樹脂純化后，雜峰有效減少，同時發(fā)現(xiàn)保留時間超過50 min的2個組分峰顯著減少，可能是由于這2種組分與大孔吸附樹脂形成較強的分子間作用力，導致洗脫劑無法有效洗脫。

3結論

紅蕓豆種皮色澤艷麗，含有豐富的花色苷。花色苷作為天然色素具有食用安全性高、多種生理功能、色調(diào)自然等特點，因而在食品和保健品領域扮演重要的角色。該研究以紅蕓豆種皮為原料，研究和優(yōu)化了大孔樹脂柱層析純化紅蕓豆種皮花色苷的方法，并對純化產(chǎn)物的純度和成分進行分析，

為紅蕓豆的開發(fā)利用提供了參考。

AB-8大孔樹脂對紅蕓豆種皮花色苷具有良好的吸附與解吸性能。采用AB-8大孔樹脂柱層析法純化紅蕓豆種皮花色苷時上樣流速宜選擇3.0 BV/h，采用100%乙醇（濃鹽酸調(diào)pH為1.0）以4.5 BV/h洗脫6 BV時解吸率最高，產(chǎn)品純度可達86.05%。HPLC對比分析提取物與純化產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)純化效果明顯。

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科技論文寫作規(guī)范——討論

著重于研究中新的發(fā)現(xiàn)和重要方面，以及從中得出的結論。不必重復在結果中已評述過的資

料，也不要用模棱兩可的語言，或隨意擴大范圍，討論與文中無多大關聯(lián)的內(nèi)容。

安徽農(nóng)業(yè)科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（26）：15-17，20