銀翹散加減對手足口病CA16病毒全基因組表達譜的影響

張澤淵, 楊宏仁

(云南省楚雄醫藥高等專科學校, 云南 楚雄, 675005)

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銀翹散加減對手足口病CA16病毒全基因組表達譜的影響

張澤淵, 楊宏仁

(云南省楚雄醫藥高等專科學校, 云南 楚雄, 675005)

目的 探討銀翹散加減對柯薩奇病毒A組16型感染手足口病恒河幼猴細胞基因表達譜的影響。方法 30只SPF級恒河幼猴，按照隨機數字表法分為治療組(15只)和對照組(15只)，治療組以銀翹散加減方保留灌腸，對照組不進行治療。連續7 d后樣本的全基因組表達譜進行PCA分析。研究2組患者基因表達譜的差異，并對差異基因行Venn 圖分析、分層聚類分析和基因本體論GO分析。結果 通過基因組表達譜共篩選到894個差異表達基因，明顯上升和下調2個大類。差異表達基因參與的富集的分子包括: 許多炎性趨化因子、參與細胞通訊、細胞周期、免疫系統過程、轉錄調節和代謝過程等生物學過程的因子。結論 2組基因表達譜存在明顯差異，差異表達基因所涉及的生物學過程與中藥減輕CA16引起的炎性趨化、免疫系統反應等有相關性。

手足口病; 銀翹散; CA16; 基因表達譜

手足口病(HFMD)是一種全球性的疾病, 本病屬于中醫學“溫病學”范疇[1], 其易感人群主要是5歲以下幼兒。近年來對于HFMD的研究大多數集中于腸道病毒71型(以下簡稱EV71)的感染。臨床上，柯薩奇病毒A組16型(以下簡稱CA16)感染所致HFMD患者一旦發展到重癥階段，其基本情況和臨床癥狀特征基本與EV71感染病例一致[2]。盡管 EV71 滅活疫苗已經上市，但缺乏CA16滅活疫苗[3], CA16感染所致HFMD也需要治療。本文從病毒學和免疫學、分子生物學、細胞生物學等方法，通過全基因組譜分析CA16所致疾病的的基因表達，為CA16 感染的中藥防治研究開拓思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

30 只SPF級恒河幼猴[由于恒河幼猴與5 歲以下幼兒體質相似故可選用，購自中國醫學科學院醫學生物學研究所靈長類實驗動物中心(滇實動證第2015006號]。體質量3.6～4.8 kg, 3～4個月周齡，分為治療組與對照組，15只/組，雌雄兼用。動物飼養于生物安全Ⅲ級實驗室[許可證號: SYX(滇)2012-0004]。給予自然光照、空氣、食物、水、玩具，溫度控制在(25±1) ℃，濕度42%～74%。采用噴霧吸毒方式，即模擬正常情況下呼吸道感染方式，CA16 感染組接種滴度為 4.7 lg CCID 50/mL的病毒液 1 mL, 隨后每天觀察所有動物的臨床癥狀及相關指標。常規飼養檢測相關指標; 治療組以銀翹散加減方保留灌腸，處方如下: 金銀花、連翹、板藍根、炒梔子、玄參、藿香(后下)、紫草、桔梗、太子參各 10 g, 荊芥穗、淡豆豉、薄荷(后下)8 g, 生石膏 20 g, 黃連、牛蒡子3 g, 生甘草6 g。每劑煎至200 mL備用。每只恒河幼猴灌腸量25～35 mL; 治療組恒河幼猴每天灌腸1次，連續7 d, 造模成功后對照組不進行治療。

1.2 儀器與方法

分離恒河猴血液中的PBMC，稀釋血樣、分離淋巴細胞、吸取 PBMC 層作為標本，采用細胞培養板、培養瓶; 無酶槍頭及無酶離心管、MEM 培養液、PBS 緩沖液、1%胰酶、4%EDTA、Gene Expression Hybridization Kit、Recombinant RNase Inhibitor、Low Input Quick Amp Labeling Kit，One-Color、定制引物、基因芯片。按照 Agilent 表達譜芯片配套提供的雜交標準流程和配套試劑盒，在滾動雜交爐中雜交cRNA上樣量 1.65 μg，并在洗缸中洗片。完成雜交的芯片采用 Agilent Microarray Scanner 進行掃描，設置 Dye channel。用 Feature Extraction software 10.7讀取數據，最后用 Gene Spring Software 11.0 處理(Quantile算法)SBC分析、Venny圖、差異表達基因的分層聚類分析、Gene Ontology分析。

1.3 觀察指標

通過PCA芯片數據、差異性表達基因、分層聚類及GO分析，研究治療組和對照組間的差異。

1.4 統計學方法

采取SPSS 21.0統計學軟件對數據進行分析處理，計數資料以百分數(%)表示，采用卡方檢驗，兩樣本均數比較用獨立樣本t檢驗，組間各時間點的比較采用單因素方差分析，組間相關采用直線相關分析，伯豪公司提供的在線 SAS系統，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CA16感染恒河猴幼猴不同時間點的PCA

分析

從圖1可知，病毒感染前，中藥治療組聚集在同一象限內，對照組在其他象限，對照組病毒感染樣本明顯離散在其余各組之外。

圖1 治療組與對照組的PCA芯片數據

2.2 CA16感染恒河猴幼猴不同時間點差異性表達基因

和治療前比較差異基因的數目, 2組差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組不同時間點差異基因的數目比較(和治療前比較差異基因的數目)

2.3 CA16感染恒河猴幼猴不同時間的分層聚類及GO分析

分析顯示，各個時間點內用中藥治療存在特異性的改變，將圖2、3的表達趨勢在表2中顯示可得差異基因分析表。治療組和對照組基因表達存在顯著差異(P<0.05), 見表2。

圖2 分層聚類(注紅代表上調、藍代表下調)

圖3 基因組GO分析

表2 差異基因分析表

“+”表示上調, “-”表示下調。

3 討 論

本實驗發現CA16感染恒河猴幼猴后，在對照組中許多參與了CA16感染導致的炎癥反應趨化因子(CXCL系列)的表達量發生了顯著改變[4]，應用中藥的治療組以上因子較對照組出現明顯下調(CXCL1、2、9、10、11), 提示中藥可減輕CA16引起的炎性反應。另外，與炎癥反應相關的細胞因子及炎癥因子包括 IL(6、8、18、1A)的表達量[5]在CA16感染后對照組中都發生了顯著變化，說明 CA16 感染激活宿主的免疫系統，從而導致炎癥反應的發生。而應用中藥組的炎癥反應相關的細胞因子及炎癥因子包括IL(6、8、18、1A)的表達量[6]在 CA16感染后和感染前相比變化較小，說明應用中藥后CA16感染雖然能夠激活宿主的免疫系統，從而導致炎癥反應的發生，但是不能引起較強的炎癥反應。將上述的這些差異性表達基因經過GO分析[7]后顯示，在細胞通訊、細胞周期、免疫系統過程、轉錄調節和代謝過程等生物學過程中，中藥能夠影響病毒對宿主的代謝反應，進而調節宿主的免疫以及減輕炎癥反應的發生。CA16感染恒河猴幼猴的全基因組分析中發現，在感染后的不同時間點，應用中藥和不用中藥均具有不同的差異性表達基因，說明隨著時間的變化, CA16感染后應用中藥治療與不治療存在特異性。

銀翹散源于《溫病條辨》[8], 既有辛透之功，又具解毒之效[9], 為溫病學中較為常用的方劑，通過一系列的加減可加強其此方面的療效。CA16感染手足口病導致死亡的原因中，肺水腫、肺出血引發的中樞神經系統病變等，都離不開炎性反應的發生[10]。名方銀翹散具有較強的抗炎作用，因此研究此方對防治HFMD引發嚴重病例及死亡病例有重要意義[11], 從研究中發現溫病學中銀翹散在HFMD治療中存在巨大價值與作用的分子基礎。

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Effect of modified yinqiao powder on whole genome spectral expression in monkey with hand-foot-mouth disease induced by CA16 virus

ZHANG Zeyuan, YANG Hongren

(ChuxiongMedicalandPharmaceuticalCollege,Chuxiong,Yunnan, 675005)

Objective To investigate effect of modified yinqiao powder on the expression of gene profiling in monkey with hand-foot-mouth disease infected by CA16 cells of genomics. Methods Thirty SPF Ganges river young monkey were randomly divided into treatment group (n=15) and control group (n=15). The monkeys in treatment group were treated with yinqiao powder, while the monkeys in control group were treated nothing. After 7 days, sample gene expression profiles were analyzed by PCA. The gene expression patterns between two groups were studied. Results Totally 894 differentially expressed genes were screened by gene expression profiles, which were significantly clustered into 2 major types. Differential expression of genes involved in the enrichment of molecular function, including many inflammatory chemokines expression, cell communication, cell cycle, regulation of the immune system process, transcription and metabolism process of biological process. Conclusion There are significant differences in the gene expression profile of ovarian granulosa cells between the two groups. The biological processes involved in the differential expression of genes are related to the effects of yinqiao powder on CA16 induced inflammatory chemotaxis and immune system response.

hand-foot-mouth disease; yinqiao powder; CA16; gene expression profile

2017-01-09

中醫科學院重大創新、綜合性中藥新藥研究開發技術大平臺建設項目(2014ZX9301-007)

R 511

A

1672-2353(2017)09-126-03

10.7619/jcmp.201709033