采用生色底物測定尿激酶效價的方法探討

謝京

摘 要：文章提供了一種采用生色底物測定尿激酶效價的方法，即使用L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽作為底物來進行分析。采用此生色底物法測得結果與氣泡法測定結果基本上是一致的。經實驗證明，生色底物法更易于操作，簡捷快速，準確度及重現性也較好。

關鍵詞：尿激酶 效價測定 底物

中圖分類號：Q556.9 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2017）04（c）-0167-02

尿激酶由人體腎臟生成，是可以通過人體新鮮的尿液進行分離提純進而得到的一種堿性蛋白水解酶。而要測定尿激酶的效價方法有很多，如平板法、小球下落法、合成底物法以及《中華人民共和國藥典》記載的氣泡上升法等。此文采用生色底物法測定尿激酶效價，使用L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽作為底物，是依靠尿激酶的酶活性來水解底物產生對硝基苯胺，并選擇在405 nm波長處測定吸光度。

1 材料

1.1 儀器與試藥

日本島津UV-2550紫外分光光度計。

尿激酶標準品購自中國藥品生物制品檢定所；尿激酶供試品購自北京唯美生物技術公司；L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽購自積水化學工業株式會社；明膠為生物試劑；三羥甲基氨基甲烷、氯化鈉、冰醋酸、均為分析純。

1.2 溶液制備

醋酸溶液配制需取20 mL冰醋酸用純化水稀釋成50 mL；

需用純化水稀釋L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽配制成濃度為0.6 mmol/L的底物溶液。

緩沖液的配制需將三羥甲基氨基甲烷6.06 g和氯化納2.22 g放在一起，大約加700 mL純化水進行溶解；再單獨取10 g明膠加適量的純化水進行加熱溶解。將此溶液擱置直到涼了以后，再將這兩種溶液混合在一起搖勻，取稀鹽酸將溶液的pH值調至8.8，再往里加入純化水稀釋至1 000 mL。

2 確定測定條件的方法

2.1 反應時間的確定

當水浴溫度為37 ℃時，取60 IU/ml的供試品溶液與底物溶液混合在一起進行反應5～40 min。經過抽取不同時間的檢測結果發現，在30 min以內的酶反應速度呈現出有規律的遞增趨勢，而在30 min過后的酶反應速度的遞增趨勢卻沒有之前那么明顯，有所減弱。故測定過程中酶反應的時間確定為30 min。

2.2 檢測波長的確定

要確定檢測波長，需取底物溶液分別與30 IU/mL、120 IU/mL 2種不同濃度的供試品溶液混合在一起發生反應，最后分別往里加入醋酸溶液搖勻，反應停止，選擇在波長范圍250～480 nm內進行測定其吸收光譜。與此同時尿激酶水溶液、底物溶液以及緩沖液的吸收光譜也需要一一進行測定。通過反復實驗，在波長為405 nm處時緩沖液有少量吸收，而尿激酶水溶液和底物溶液都沒有吸收，但是發生化學反應后所生成的產物卻對硝基苯氨有吸收。所以試驗過程中選用測定吸光度的檢測波長定為405 nm。

2.3 底物濃度的確定

37 ℃水浴中，采用配制好的pH8.8的緩沖液稀釋尿激酶標準品成30 IU/mL的溶液，測定得到米氏常數Km=5.5×10-5mol/L。用純化水配制不同濃度的底物溶液。從理論知識上我們知道了當底物濃度達到最大值的合理濃度時酶反應會激發它最大的活性，底物濃度為10 Km時反應速度在理論上計算出的約91%的極限值。檢測酶活性時底物濃度有輕微改變，但幾乎不影響反應的速度，如有物質會抑制酶進行反應，在底物用量為10 Km時幾乎不影響反應的速度，則說明在一定時間段內反應的速度恒定不變。所以底物濃度標準設定為0.6 mmol/L。

2.4 緩沖液pH值的確定

緩沖液配制過程中，將兩種溶液混合均勻后，用稀鹽酸分別調制成若干pH值不同的溶液，然后再分別與尿激酶供試品混合配制成30 IU/mL的溶液，再與配制好的底物溶液混合發生反應。隨后采用分光光度法在波長405 nm處測定其吸光度。反復試驗后得出緩沖液的pH值于8.5～9.0時測出的酶活性最高。因此緩沖液的最佳pH采用8.8。

2.5 水浴溫度的確定

眾所周知，水浴溫度對某些物質之間進行的化學反應是有一定影響的，而對尿激酶效價的檢測方法卻也是對水浴溫度有一定要求。用30 IU/mL供試品溶液與底物溶液混合，讓其分別在不同溫度的水浴中進行化學反應，結果卻發現，不同溫度下測得的結果卻是有區別的。經過反復試驗測出37 ℃是個臨界點，低于37 ℃測到的酶活性會隨著水浴溫度的升高呈上升趨勢。當水浴溫度位于37 ℃～45 ℃之間時，所測到的酶活性是最高的。而超過45 ℃之后呈下降趨勢，這說明過高溫度會破壞酶的活性。所以37 ℃可以作為檢測尿激酶效價測定實驗時的水浴溫度選擇。

3 測定方法及回收率試驗

3.1 制備標準曲線

采用緩沖液將尿激酶標準品正確調配為50 IU/mL的尿激酶標準溶液。取干凈小試管6支并往每支試管內都加入2.0 mL的底物溶液，置于37 ℃水浴中。接著將不同量的尿激酶標準液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別加入到6支試管內，再根據每個試管的溶液量多少分別加入緩沖液至1.0 mL。經過30 min準確無誤的反應過后，再分別往小試管里加入1.0 mL醋酸溶液搖勻，反應停止。放至室溫，在選定波長405 nm處測定其吸光度。最后計算標準曲線方程，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得出：Y=0.0304+0.05355X，r=0.9984，n=3。反復試驗檢測結果顯示，在濃度范圍10～50 IU/mL內尿激酶與吸收度持線性關系。

3.2 穩定性試驗

待制備好標準曲線后將其溶液放于室溫，分別在不同的時間一一測定其吸光度，最后結果顯示24 h內吸光度并沒有明顯變化。

3.3 回收率試驗

通過在相同的條件下進行的6次試驗記錄下的結果可以利用回歸方程計算出濃度，所得平均回收率為101.4%，相對標準偏差為0.86%。試驗過程如下：取2.0 mL的底物溶液于干凈小試管內后并將其置于37 ℃的水浴中。同時取10 mL 30 IU/mL的尿激酶供試品溶液與10 mL 30 IU/mL的尿激酶標準溶液混合在一起搖勻。接著往小試管內加入上述兩者混合的尿激酶溶液1.0 mL。經過30 min準確無誤的反應過后往小試管內加入1.0 mL醋酸溶液搖勻，反應停止。放至室溫，并在選定的波長405 nm處測定其吸光度。

4 尿激酶供試品的效價測定

采用回收率試驗中所使用的測定方法，取尿激酶供試品用緩沖液稀釋至30 IU/mL的溶液進行測定，6次結果記錄好，以便與用氣泡上升法測試出來的結果進行對照。配制試劑溶液和測定供試品效價的方法均按《藥典》2010年版二部尿激酶效價測定法進行，采用此公式計算結果，尿激酶效價=（供試品單位數每毫升單位數×稀釋倍數）/取樣量。采用兩種方法進行測定后所得結果對照如表1。然而在實際操作過程中如若不小心讓微生物污染了底物溶液，則會引起底物水解從而使得實際的底物濃度要偏低， 最后會對測定結果產生影響。將調制好并已放了3 d的底物溶液與剛配好的新鮮底物溶液在完全相同的反應條件下分別進行反應。通過檢測顯示擱置了3 d的底物溶液反應后在波長405 nm處被測到的吸光度與新鮮溶液比較已經有所下降了。因此在配制溶液時所需的容器、溶劑都需要通過無菌消毒處理，如此便可以更好地延長底物溶液的貯存時間。

從表1的結果可以看出，生色底物法測定的尿激酶效價的結果與藥典記載的氣泡上升法測定出來的結果基本上是一致的。

5 結論

綜上所述，文章歸納了酶反應最適合的基礎條件是：37 ℃水浴溫度，采用pH8.8的三羥甲基氨基甲烷-明膠緩沖液配制的尿激酶溶液與底物溶液濃度為0.6 mmol/L發生反應30 min。最后再往里加入醋酸溶液搖勻，反應終止，通過分光光度計在波長405 nm處測定其吸光度。記錄后的結果表明尿激酶濃度在10～50 IU/mL范圍內與吸光度之間呈線性關系。

藥典記載的氣泡上升法也可以測定尿激酶效價，但與生色底物法相比，氣泡上升法在測定過程中存在著較多的問題。因為氣泡上升法在測定尿激酶效價時使用的試劑會相對偏多，而且都是一些蛋白質或者酶類物質，這些物質都很容易發生質變。最后還是通過肉眼來決定反應的終點，如此就易產生由人為因素而引起的誤差。而文章講述的生色底物法卻是利用尿激酶與所選底物L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽進行反應從而產生淡黃色針狀結晶物對硝基苯胺，再通過紫外可見分光光度計進行分光光度法測定其吸光度。與氣泡上升法相比較，生色底物法更易于操作，簡捷快速，準確度及重現性也較好。

參考文獻

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