MicroRNA通用探針法的建立及布魯氏菌病患者血漿microRNA-146a的檢測

程慧敏，魏青青，張 歡，劉金玲，韓小虎，王大力，王興龍

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MicroRNA通用探針法的建立及布魯氏菌病患者血漿microRNA-146a的檢測

程慧敏1，2，魏青青2，張 歡2，劉金玲2，韓小虎2，王大力3，王興龍1

目的 建立一種通用、敏感、特異的microRNA檢測方法，用于檢測布魯氏菌病患者血漿microRNA-146a的表達，探討其作為診斷標識的可能性。方法 以microRNA-146a模擬物為待檢物，通過正交實驗設計，對退火溫度、探針濃度、試劑盒選擇進行優化，建立特異敏感的通用檢測方法；從布病患者和正常健康人血漿樣本提取RNA，應用通用探針法進行檢測，比較布病患者血漿microRNA-146a的表達變化。結果 建立了優化的通用探針法，與染料法相比特異性更強、擴增范圍更大，具有通用檢測能力。應用通用探針法檢測布魯氏菌病患者血漿microRNA-146a，發現布病患者血漿中microRNA-146a的表達被抑制(P<0.01)，表明其可能作為布病診斷的分子標識。結論 經優化的通用探針法是一種通用、敏感、特異的檢測方法，可用于microRNA的檢測，microRNA-146a可能作為布病診斷的標識分子。

通用探針法；正交設計；microRNA-146a；布魯氏菌病

microRNA (miRNA)是一類由內源基因編碼的長度約為19-22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,可以作為疾病特征性標識[1]。但因其片段較短，易降解且表達量不高，多采用熒光定量法進行檢測。不同microRNA同源性較高[2]，探針法的特異性遠高于染料法，但是熒光定量探針法在檢測目的基因時,需要針對每個microRNA設計探針進行檢測，實驗成本高，操作要求高[3]，在臨床檢測中受到一定限制。本研究在TaqMan熒光定量PCR的基礎上建立一種通用探針法，通過設計新的通用探針和引物，使用正交設計法對多因素進行優化，不僅能擴大檢測范圍和靈敏性，也為熒光定量法microRNA檢測條件的優化提供參考[4-6]。最后應用通用探針法對布病患者血漿中的microRNA-146a進行檢測，探討其作為診斷標識的可能性。

1 材料與方法

1.1 模擬物合成與樣本準備 模擬物由上海吉瑪公司合成，序列為Has-microRNA-146a-5p(5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′),12 000 r/min離心5 min，將模擬物稀釋至0.2 μmol/L。布魯氏菌病患者血漿樣本來源于黑龍江農墾總局總醫院，試管凝集試驗進行血清學檢測，抗體滴度在1∶50以上視為陽性，健康志愿者血漿樣本來源于中國疾病預防控制中心鼠疫布病防治基地。收集清晨空腹全血樣本2 mL，采用枸櫞酸鈉抗凝管，4 ℃靜置4 h后4 000 g/min離心5 min，小心分離上層血漿后保存于-80 ℃。

1.2 RNA提取與反轉錄 RNA提取采用傳統trizol法(Invitrogen，TRIzol○R Reagent)，取200 μL血漿，加入相應體積trizol后，震蕩混勻，靜置5 min。加入40 μL氯仿，震蕩，靜置5 min后4 ℃ 12 000 g 25 min。吸去上層至新管，加200 μL異丙醇-20 ℃過夜,4 ℃ 12 000g離心 25 min棄上清。用200 μL 75%酒精洗滌RNA沉淀一次，使RNA重懸,4 ℃ 12 000 g離心15 min。棄上清，倒置控干酒精，加15 μL DEPC水溶解，-80 ℃保存。超微量紫外分光光度計(NanoDrop2000)測定RNA濃度均>100 ng/μL,OD268/OD280=1.8-2.0。

將20份健康志愿者血漿樣本RNA各取2 μL制成混合RNA樣本。將混合RNA樣本、布魯氏菌病患者血漿RNA樣本和健康志愿者血漿RNA樣本各20份分別加Poly(A)尾，布魯氏菌病患者和健康志愿者加尾產物逆轉錄，逆轉錄嚴格按照天根生化科技(北京)有限公司miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒操作說明書進行。逆轉錄引物序列：5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT CAG AGC CAC CTG GGC AAT TTT TTT TTT TVN-3′，由Takara公司合成。反應在金屬浴(卡尤迪H2O3-100C)中進行，完成后cDNA保存于-20 ℃。

1.3 通用探針法建立與條件的優化 建立通用探針法，microRNA-146a上游引物序列：5′-TGA GAA CTG AAT TCC ATG GGT T-3′，通用下游引物序列：5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′，通用探針：5′-FAM-CAG AGC CAC CTG GGC AAT TT-BHQ1-3′[7]，序列均由Takara公司合成。

采用正交設計，對通用探針法的反應體系和反應程序進行優化，主要包括試劑盒、退火溫度和探針濃度。與普通PCR不同，多數熒光定量PCR試劑盒多將Taq酶,buffer,dNTPs,MgCl2等制成混合溶液，因為混合溶液配比不同，Taq酶不同等，故擴增效率也不同。本實驗將不同試劑盒混合溶液作為一個可變因素[8]，結合溫度、探針濃度共3因素，選定4個水平。以microRNA-146a為例，對濃度為0.2×10-2μmol/L模擬物microRNA-146a進行擴增,產物長66 bp。設計因素及其水平,見表1。[L16(4)3]正交設計表，見表2。實時熒光定量PCR反應液購于康維世紀的GoldStar TaqMan Mixture (Low ROX)，Takara公司的Premix Ex Taq(Probe qPCR)試劑盒，TRANSGEN biotech公司的2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒，天根生化科技公司的SuperReal PreMix(Probe)。將反應體系縮小至10 μL，反正程序按照試劑盒說明書進行。擴增反應在美國Bio-Rad公司的IQ5實時定量PCR儀上進行，每次試驗進行3次獨立重復實驗。

表1 正交設計因素及其水平
Tab.1 Influential factors and counts of orthogonal design

水平Counts因素Factors試劑盒MasterMix退火溫度(℃)AnnealingTemperature探針濃度(μmol/L)Probeconcentration1GoldStarTaqManMixture620.22PremixExTaq60.70.43EasyTaqPCRSuperMix58.40.64SuperRealPreMix550.8

表2 [L16(4)3]正交設計表
Tab.2 [L16(4)3]Orthogonal design table

因素Factors試驗編號Experimentsnumber試劑盒MasterMix退火溫度(℃)AnnealingTemperature探針濃度(μmol/L)Probeconcentrration11112122313341445212622372348241931310324113311234213414144211543216443

1.4 通用探針法評價 將通用探針法與SYBR GreenI染料法進行對比，在臨床樣本中對通用探針檢測方法進行評價。評價包括性能和通用性兩方面。性能的評價是將混合的RNA樣本加Poly(A)尾，分別取4、2、0.4 μL加尾產物用于逆轉錄，使用通用探針法和SYBR Green I染料法擴增血漿樣本中的microRNA-146a、microRNA-122和microRNA-155，比較通用探針法和SYBR GreenI染料法的性能方面的差別。通用性評價是將混合的RNA樣本加poly(A)尾，取4 μL加尾產物用于逆轉錄，使用通用探針法和SYBR Green I染料法擴增血漿樣本中的microRNA-155、microRNA-146b、microRNA-223、microRNA-181c、microRNA-27a、microRNA-29a、microRNA-29b-1、microRNA-146a共8條microRNA，探索通用探針法對不同microRNA擴增的通用性。實驗均以RNase free H2O作為陰性對照。

1.5 通用探針法的應用 將模擬物進行10倍梯度稀釋，共5個濃度梯度(0.2-0.2×10-4μmol/L)，應用最佳反應條件進行熒光定量PCR，繪制microRNA-146a標準曲線。將20例布魯氏菌病患者和20例健康志愿者分為患病組和健康組，統計樣本信息。應用通用探針法，根據microRNA-146a標準曲線計算臨床樣本microRNA-146a濃度。

1.6 數據統計方法 應用SPSS 17.0軟件和Microsoft Excel 2007進行數據統計分析,采用兩獨立樣本t檢驗。P≤0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 通用探針法的建立和條件的優化 通用探針法的原理是在加Poly(A)尾之后，用與含有通用探針互補序列的引物進行逆轉錄，產物用通用引物、通用探針和microRNA特異引物進行擴增，從而實現一次逆轉錄可檢測多個不同的microRNA分子，而優化的擴增體系是確保擴增效率的關鍵。以microRNA-146a為例，設計通用引物和探針，并對通用探針法的體系進行摸索和優化。通過統計學分析，試劑盒種類、退火溫度以及探針濃度三因素相互獨立，P>0.05。分析3次獨立重復實驗標準差， σ<0.5。熒光定量擴增Ct值見表3，對結果進行直觀分析[9]。第1、4、9、11、14次試驗，擴增效果極差，循環數大于40。第7和12次實驗，標準差σ>0.5，實驗重復性差，結果不可靠。在其余9次實驗中，第3次實驗結果擴增曲線完整平滑,見圖1。3次獨立重復實驗σ=0.14，Ct=31.28，實驗重復性好，經過優化設計Ct值提高了,檢測濃度下限提高10倍，見圖1和圖2。在第3次實驗中，使用2×GoldStar TaqMan Mixture，探針濃度為0.6 μmol/L，退火溫度為58.4 ℃。比較多次實驗可以得出最佳反應程序：第一階段95 ℃預變性10 min；第二階段95 ℃變性15 s，58.4 ℃退火和延伸40 s，收集熒光信號，進行40次循環。最佳反應體系見表4。通過正交設計優化通用探針法反應條件，提高了檢測的靈敏性，擴大了檢測范圍。

表3 [L16(4)3]正交設計結果
Tab.3 [L16(4)3] Orthogonal design result

試驗編號Experimentnumber重復1Repeat1重復2Repeat2重復3Repeat3標準差σStandarddeviationCt平均值CtMeanvalue135.79N/A6.19——232.132.5231.580.47088632.06667331.3431.1231.390.14364331.283334N/AN/AN/A——534.0834.0534.080.01732134.07632.9233.0832.990.08020832.99667733.04N/A31.431.13844232.235832.7232.6632.620.05033232.666679N/AN/AN/A——1035.4834.9736.660.86685335.7033311N/A37.57N/A——1236.6134.1233.231.7519834.653331334.0534.0934.190.07211134.1114N/AN/AN/A——1535.0434.1734.530.4371534.581634.2333.9734.790.41904734.33

圖1 優化前試驗的擴增曲線Fig.1 Amplification curve of non-optimizational real-time PCR reaction

圖2 正交設計第3次試驗的擴增曲線Fig.2 Amplification curve of optimizational real-time PCR reaction

表4 優化的血漿microRNA-146a熒光定量PCR體系
Tab.4 Optimizational real-time PCR reaction of plasma microRNA-146a

反應成分Reactioncomponents反應體系/μLReactionsystem終濃度Finalconcentration2×GoldStarTaqManMixture51×10×buffer11×Primer(F)0.20.2μmol/LPrimer(P)0.20.2μmol/LProbe0.60.6μmol/LRNAfreeH2O3—Total10—

2.2 通用探針法的敏感性和特異性 在臨床樣本檢測中，通用探針法的性能明顯優于SYBR Green I染料法，見表5。將兩種檢測方法進行縱向對比，當加尾產物量不同時，通用探針法中加尾產物量越高，循環數越小，即通用探針法可以準確的區分出血漿樣本中目標microRNA的含量，含量越高，越容易檢測。但是SYBR Green I染料法檢測microRNA-122時，加尾產物量越高反而循環數越小，對于血漿樣本中的目標microRNA濃度的檢測并不準確，在檢測microRNA-155時，陰性對照也產生了熒光信號，表明SYBR Green I染料法只有在microRNA濃度較高時才能檢測到，靈敏性差。將兩種檢測方法進行橫向對比，在檢測同一條microRNA的相同加尾產物量時，通用探針法的靈敏性均高于染料法，且陰性對照沒有熒光信號，不存在干擾，在進行大量樣本篩查時具有較大優勢。

表5 SYBR Green I染料法和通用探針法性能比較結果
Tab.5 Efficiency comparison results of SYBR Green I assay and universal probe assay

加尾產物量(μL)Poly(A)prudct(μL)染料法SYBRGreenIassay探針法UniversalprobeassaymiR-146amiR-155miR-122miR-146amiR-155miR-122434.7234.8797535.5408233.6879729.6488133.22255235.8436.4399237.3085734.3976230.4812733.670340.436.1636.1163236.6971238.19017—36.19771陰性對照—36.60477————

2.3 通用探針法通用性 在臨床樣本檢測中，使用通用探針法和SYBR GreenI染料法對隨機挑選的8條microRNA進行擴增，結果見表6。通用探針法可對8條microRNA進行檢測，除microRNA-146a,其余血漿樣本中microRNA循環數均在35個循環及以下，陰性對照均沒有擴增。雖然通用探針法在擴增microRNA時循環數較大，但是SYBR Green I染料法陰性對照均產生了熒光信號，對目標microRNA存在干擾，如microRNA-223和microRNA-155，血漿樣本和陰性對照循環數接近，結果難以判斷。綜上，說明通用探針法具有良好的特異性和通用性。

表6 SYBR Green I染料法和通用探針法通用性比較結果
Tab.6 Universal comparison results of SYBR Green I assay and universal probe assay

Ct值CtvaluemiR-146amiR-146bmiR-223miR-155miR-29amiR-181cmiR-27amiR-29b-1染料法SYBRGreenIassay樣本Sample33.9029.8832.9433.5831.8735.3932.3734.64陰性Control37.2533.3233.5234.0735.4337.5939.6736.73探針法Universalprobeassay樣本Sample37.6931.1432.6432.0934.6735.6935.6035.73陰性Control————————

2.4 通用探針法檢測布魯氏菌病患者血漿microRNA-146a 將模擬物microRNA-146a進行10倍梯度稀釋，應用通用探針法，得到microRNA-146 a擴增曲線，對數圖見圖3。根據microRNA-146a擴增曲線繪制microRNA-146a標準曲線，見圖4。該標準曲線包括5個數量級，下限可至20 pmol/L。R2=0.9816,K=-3.112,E=1.09，表明具有良好的線性關系，各稀釋度間相關性好、誤差小。成功建立microRNA-146a標準曲線，可進一步對每一例血漿樣本中的microRNA-146a進行絕對定量分析。

將通用探針法應用于臨床樣本的檢測，比較布魯氏菌病患者和健康志愿者血漿樣本中的microRNA-146a表達水平。統計樣本基本信息，患病組年齡在4到71歲之間，20人中女性有7人，健康組年齡在16到83歲之間，20人中女性有9人，患病組和健康組年齡和性別差異不具有統計學意義(P>0.1)。患病組者抗體滴度均大于50 IM/mL,健康組試管凝集試驗呈陰性。根據microRNA-146a標準曲線，采用絕對定量分析方法[10]計算樣本中microRNA-146a的濃度。患病組血漿microRNA-146a濃度從14.74 nmol/L到8 447.26 nmol/L(95%CI：23.45-1 799.86)，健康組microRNA-146a濃度從97.99 nmol/L-140 192.41 nmol/L(95%CI：17 013.24-48 218.79)。患病組和健康組樣本基本信息及數據結果，見表7。

圖4 模擬物microRNA-146a標準曲線Fig.4 Standard curve of microRNA-146a mimics

表7 樣本信息及數據結果
Tab.7 Information and result of plasma sample

特征信息Characteristics患病組(n=20)Brucellosis健康組(n=20)HealthyvolunteerP樣本信息Sampleinformation平均年齡Meanage46.0547.85>0.1年齡95%CIAge95%CI37.48-54.6239.62-56.08性別(女,%)Sex(Female,%)35%45%>0.1抗體滴度范圍(IΜ/mL)SATtiter(IM/mL)50-800——數據結果Resultofanalysis濃度平均值(nmol/L)MeanConcentration911.6632616.02<0.01標準差σStd.Deviation1897.8233338.24抽樣標準誤差Std.ErrorofMean424.37 7454.66濃度95%CIConcentration95%CI23.45-1799.8617013.24-48218.79濃度最大值(nmol/L)Upperconcentration(nmol/L)8447.26140192.41濃度最小值(nmol/L)Lowerconcentration(nmol/L)14.7497.99

比較患病組和健康組血漿microRNA-146a表達水平，進行統計學分析，Levene檢驗方差不齊,P<0.05，兩獨立樣本t檢驗P<0.01，患病組和健康組血漿microRNA-146a表達水平差異具有統計學意義。患病組和健康組血漿microRNA-146a表達水平差異有統計學意義，患病組血漿microRNA-146a表達水平低于健康組，繪制柱狀散點圖，見圖5。

圖5 患病組與健康組血漿microRNA-146a表達差異Fig.5 Expression of plasma microRNA-146a in patients group and control group

3 討 論

MicroRNA作為一類基因表達調控分子，在基因表達調控中發揮著非常重要的作用[11]。越來越多的研究發現，microRNA可作為疾病的診斷標志物用于疾病診斷[12-13]，因此，有關microRNA的檢測方法的文章呈指數級增長。目前的檢測方法主要有兩大類，一是基于染料法的通用檢測方法，一次加尾逆轉錄后可以檢測很多個靶標分子[14-15]，另一個是基于特定microRNA序列的探針法，一次只能檢測一個靶標分子[16-17]。從原理上看，前者通用性好，但特異性不足，后者特異性較好，但通用性不足，成本高，檢測過程復雜。而通用探針法則是結合兩者的優點，一步逆轉錄后可以用探針實現多個靶標分子的檢測。

本研究中，我們對通用探針法進行了系統的優化，設計了新的通用探針，對影響探針法的因素采用正交設計的方法進行了系統的優化，從而建立了敏感特異的檢測方法。從優化過程的數據看，引物探針濃度、退火溫度和所用檢測試劑均會影響檢測效率。采用正交設計方法比單個因素逐步優化的優勢在于，能夠尋找到多個因素相互作用及同步優化的作用[18]。所以，盡管設計的優化實驗反應數大，正交設計優化能夠獲得最優的反應條件，這也為其它檢測方法的建立和優化提供借鑒。同時對通用探針法的性能和通用性進行了討論，發現該方法與常用的SYBR GreenI染料法相比具有良好的性能和通用性，在檢測臨床樣本時，對于靶標microRNA反應靈敏高效，可同時可對多條microRNA進行檢測，且特異性好、沒有干擾。

布魯氏菌病是一種慢性感染性疾病，布魯氏菌感染宿主后會抑制宿主免疫，使細菌能夠在宿主內生存繁殖[19]。因此，感染布魯氏菌的患者會表現一定的免疫抑制，而這種免疫狀態的改變可能作為診斷的標記。MicroRNA-146a是一類與免疫調控相關的microRNA分子，已經證實其參與了很多免疫反應的調節[20-21]。本研究中，我們比較分析了布病患者血漿中microRNA-146a的表達，并與健康人進行比較，結果發現，感染布魯氏菌的患者血漿中microRNA-146a的表達水平被顯著抑制，這提示microRNA分子可能作為一個布病診斷的分子標記。但是，由于本研究中只比較分析了數量較少的樣本，這種規律還需要進一步擴大樣本進行驗證。另一方面，microRNA-146a作為一種調控分子，會因各種因素的影響發生變化，所以這種變化不是布魯氏菌感染所特異的，因此，在作為診斷標識的過程中，還需考慮其它因素。

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Development of a universal probe based microRNA assay and detection of plasma microRNA-146a of human brucellosis

CHENG Hui-min1，2,WEI Qing-qing2,ZHANG Huan2,LIU Jin-ling2,HAN Xiao-hu2, WANG Da-li3,WANG Xing-long1

(1.InstituteofMilitaryVeterinary,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Changchun130122,China; 2.ShenyangAgricultureUniversity,Shenyang110866,China; 3.PestisandBrucellosisTherapeuticBase,ChineseCentersforDiseaseControlandPrevention,Baicheng137000,China)

We developed a universal probe based microRNA detection assay and applied it to detect microRNA-146a in human brucellosis,testing the possibility of using it as diagnosis signature. By using orthogonal design,the annealing temperature,probe concentration and commercial kits were optimized and the assay was developed. Total RNAs were isolated from plasma of human brucellosis and healthy control,and microRNA-146a was detected and compared. Results reveal that the optimized universal probe assay was established,which was more specific than the SYBR GreenI assay,and had a wider range of amplification. Compared with healthy control,the application of universal probe assay for the detection of serum microRNA-146a in patients with brucellosis was significantly inhibited (P<0.01). Implying the potential of microRNA-146a as biomarker in diagnosis of brucellosis.It is suggested that universal probe based assay is a universal,specific and sensitive method for microRNA detection. MicroRNA-146a represents a potential biomarker for human brucellosis diagnosis.

universal probe assay; orthogonal design; microRNA-146a; human brucellosis

Wang Xing-long,Email: wangxl-2006@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.011

王興龍,Email:wangxl-2006@163.com

1.軍事獸醫研究所,軍事醫學科學院，長春 130122； 2.沈陽農業大學,沈陽 110866； 3.中國疾病預防控中心鼠疫布病防治基地,白城 137000

R378.5

A

1002-2694(2017)05-0441-08

2016-07-21 編輯：王曉歡