miR-16在金黃色葡萄球菌膿毒癥中的表達(dá)及意義探討

王家學(xué)，陳 燕，劉小香，孫愛(ài)華，楊 珺，呂火烊，周永烈

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miR-16在金黃色葡萄球菌膿毒癥中的表達(dá)及意義探討

王家學(xué)1，陳 燕2，劉小香3，孫愛(ài)華3，楊 珺1，呂火烊4，周永烈4

目的 探討miR-16表達(dá)水平與金黃色葡萄球菌膿毒癥嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)一步探討其潛在的臨床意義。方法 收集金黃色葡萄球菌膿毒癥血液標(biāo)本共計(jì)32例，膿毒性休克、嚴(yán)重膿毒癥和一般膿毒癥各8例，不同年齡段的健康對(duì)照24例；另外，收集革蘭氏陰性菌膿毒癥血液標(biāo)本8例。用Trizol液裂解全血后提取microRNA，采用熒光定量PCR測(cè)定miR-16在不同組的表達(dá)水平(2-△△Ct法)，用SPSS 13.0軟件分析各組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用SPSS 13.0軟件將miR-16定量值與相應(yīng)CRP和PCT值進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 miR-16表達(dá)水平與金黃色葡萄球菌膿毒癥嚴(yán)重程度呈明顯的負(fù)關(guān)聯(lián)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，實(shí)驗(yàn)組之間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。miR-16表達(dá)水平與CRP和PCT值呈負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為-0.561和-0.769。結(jié)論 miR-16表達(dá)與金黃色葡萄球菌膿毒癥有明顯的負(fù)關(guān)聯(lián)性，提示其可能作為該菌膿毒癥嚴(yán)重程度的標(biāo)記物。

miR-16;金黃色葡萄球菌;膿毒癥

金黃色葡萄球菌可引起臨床嚴(yán)重感染。膿毒癥是在細(xì)菌感染基礎(chǔ)上以促炎癥激活過(guò)程為特征的全身性反應(yīng)狀態(tài)[1]，死亡率高且患病率正逐年遞增[2]。目前，膿毒癥治療主要為抗菌和抗炎，但這些方法的臨床應(yīng)用效果有限。微小RNA(microRNA，又稱(chēng)miRNA或miR)可調(diào)控炎癥通路上的多個(gè)靶點(diǎn)，在免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[3]。miRNA是生物體內(nèi)長(zhǎng)度約23個(gè)核苷酸左右的非編碼小RNA，可與蛋白編碼的mRNA互補(bǔ)配對(duì)而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因表達(dá)[4]。它也能通過(guò)調(diào)控膿毒癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一些關(guān)鍵分子而間接調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子的表達(dá)平衡[5]。鑒于miRNA對(duì)膿毒癥炎癥反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，深入研究其在金黃色葡萄球菌膿毒癥炎癥反應(yīng)中的作用，可對(duì)該病的預(yù)防和治療開(kāi)拓一種潛在思路。

miR-16能防止炎癥反應(yīng)過(guò)度擴(kuò)大[6]，在促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)的降解方面發(fā)揮必要性作用[7]。miR-16與金黃色葡萄球菌膿毒癥是否有關(guān)聯(lián)，目前尚無(wú)報(bào)道。本研究根據(jù)膿毒癥定義及嚴(yán)重程度分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，收集了不同嚴(yán)重程度的金黃色葡萄球菌膿毒癥臨床血標(biāo)本，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)患者血液中miR-16表達(dá)水平，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法探討了miR-16表達(dá)是否與膿毒癥嚴(yán)重程度有關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)一步探討miR-16的臨床意義，本文也將其表達(dá)水平與CRP和PCT值進(jìn)行了相關(guān)性分析。期望可為進(jìn)一步探討miR-16在金黃色葡萄球菌膿毒癥發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為該菌膿毒癥的預(yù)防和治療找到合理、有效的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 患者與健康對(duì)照 根據(jù)臨床資料選取合適的膿毒癥患者，臨床病例和健康對(duì)照均顯示無(wú)慢性炎癥反應(yīng)性基礎(chǔ)疾病史。本研究納入了24例金黃色葡萄球菌膿毒癥患者、8例革蘭氏陰性菌膿毒癥患者和24例健康對(duì)照者，標(biāo)本采集均獲得了受試者的知情同意。血液標(biāo)本在診斷為膿毒癥后的4 h內(nèi)采集，抽取患者的抗凝血標(biāo)本。抽取新鮮血液后，立即將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶試管，用Trizol液裂解血標(biāo)本，置于-80 ℃冰箱保存待用。

依據(jù)《華盛頓國(guó)際膿毒癥定義會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)》定義膿毒癥，患者符合：存在感染所致的損害性全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，有明確或疑似感染灶，以及器官存在損害表現(xiàn)。診斷標(biāo)準(zhǔn)為患者有明確的感染或可疑感染，同時(shí)伴有發(fā)熱(體溫>38.3 ℃)或低溫(<36.0 ℃)；心率大于90 bpm或大于不同年齡的正常2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差；氣促大于30 bpm，意識(shí)狀態(tài)發(fā)生變化；明顯水腫，或液體正平衡大于20 mL/kg超過(guò)24 h；高糖血癥但未顯示糖尿病史。嚴(yán)重程度分級(jí)依據(jù)《2012年國(guó)際嚴(yán)重膿毒癥及膿毒性休克診療指南》和參考文獻(xiàn)[8]。

1.2 主要材料與試劑 從http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/網(wǎng)站搜索miR-16序列(UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG)，miR-16特異性引物由瑞博生物技術(shù)有限公司合成，血標(biāo)本裂解液(Trizol，#R401-01)和熒光定量PCR試劑(SYBR Green Master Mix，#Q111-02)購(gòu)自Vazyme生物技術(shù)有限公司，microRNA抽提試劑盒(miRcute miRNA isolation kit，#DP501)購(gòu)自天根生化科技有限公司。采用羅氏電化學(xué)發(fā)光儀E170測(cè)定PCT值，采用BECKMAN特定蛋白儀IMMAGE 800測(cè)定CRP值。氯仿、苯酚和乙醇均購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。熒光定量PCR采用LightCycler 480 PCR儀(羅氏)，逆轉(zhuǎn)錄采用S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國(guó)伯樂(lè))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 取新鮮全血1 mL加入等體積Trizol裂解液，置于-80 ℃冰箱保存。小RNA提取時(shí)，取出裂解液室溫靜置5 min。12 000 r/min離心分離上清，加入等體積氯仿后室溫12 000 r/min離心，將水相轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶EP管后加入無(wú)水乙醇，室溫放置2 min。將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱室溫放置2 min，12 000 r/min離心。將離心液加入2/3體積無(wú)水乙醇，然后將混合液轉(zhuǎn)移至miRlute柱，室溫放置2 min，12 000 r/min離心30 s，加入去蛋白液后離心，再加入漂洗液、離心，最后用無(wú)RNA酶的去離子水洗脫目標(biāo)RNA。RNA逆轉(zhuǎn)錄的體系為無(wú)RNA酶水3.5 μL、4 X g DNA Wiper 2 μL、引物(2 μmol/L)0.5 μL和模板RNA 2 μL，條件為42 ℃ 2 min，然后加入2 μL 5 X HiScript Ⅱ，再50 ℃ 15 min和85 ℃ 2 min。熒光定量體系為BYBR Green 10 μL、引物各0.8 μL、逆轉(zhuǎn)錄模板2 μL和去離子水7.2 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10s，60 ℃ 30s,40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。CRP和PCT測(cè)定均按照生產(chǎn)商的操作說(shuō)明進(jìn)行。熒光定量實(shí)驗(yàn)每個(gè)標(biāo)本設(shè)置3復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用2-ΔΔCT法計(jì)算miRNA表達(dá)水平。用SPSS 13.0軟件(IBM，New York，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。熒光定量檢測(cè)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用ANOVA方差分析，采用非參數(shù)Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

本研究納入了24例金黃色葡萄球菌膿毒癥患者，其中膿毒性休克、嚴(yán)重膿毒癥和輕度膿毒癥各8例，標(biāo)本主要來(lái)源于浙江省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心和感染科。膿毒癥患者來(lái)源于ICU和老年呼吸病房，健康對(duì)照患者來(lái)源于門(mén)診體檢。本研究收集的金黃色葡萄球菌膿毒癥病例全部為60周歲以上患者，男性和女性患者分別為14例和10例。在符合膿毒癥定義和分類(lèi)基礎(chǔ)上，所選病例的患者體溫、WBC和中性粒細(xì)胞比值均明顯符合細(xì)菌感染的臨床指征。

miR-16熒光定量結(jié)果以及PCT和CRP測(cè)定值如表1所示(均值±SD，n=8/組)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-16熒光定量值，數(shù)值通過(guò)健康對(duì)照組進(jìn)行了校正。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，一般膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克組的miR-16表達(dá)量均值分別為0.2656±0.0727、0.0188±0.0043和0.0046±0.0006。與健康對(duì)照組相比，3組分別降低了3.8、53.2和217.4倍。PCT和CRP值也隨著膿毒癥程度的加重而升高(均值±SD，n=8/組)。

表1 各組受試者miR-16熒光定量值以及CRP和PCT測(cè)定值(均值±SD，n=8)
Tab.1 Measured miR-16 values and CRP and PCT values in each group (means±SD,n=8)

健康對(duì)照組Healthycontrolgroup(n=8)膿毒癥患者組Sepsispatientgroup(n=24)一般膿毒癥組Generalsepsisgroup(n=8)嚴(yán)重膿毒癥組Severesepsisgroup(n=8)膿毒性休克組Septicshockgroup(n=8)PRNAquantitativevalue10.2656±0.07270.0188±0.00430.0046±0.0006<0.001PCTvalue(ng/mL)0.18±0.050.32±0.050.61±0.134.5±3.1<0.05CRPvalue(mg/L)5.35±2.8442.16±21.8495.63±18.55289.75±154.91<0.001

注：P值計(jì)算是依據(jù)各膿毒癥組v.s.健康對(duì)照組。
Note: The p value was calculated based on each sepsis group v.s. healthy control group.

本文的金黃色葡萄球菌膿毒癥均為60周歲以上患者，為了排除患者的生理因素對(duì)miR-16表達(dá)水平的影響，本文選取了24例來(lái)自不同年齡段的健康受試者進(jìn)行了miR-16表達(dá)水平的比較，60周歲、18-59周歲和2-18周歲的受試者各8例，miR-16表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，3個(gè)年齡組的健康受試者miR-16的表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≥0.05)。

在金黃色葡萄球菌膿毒癥中，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于健康對(duì)照組miR-16水平均呈顯著性下降，而且隨著膿毒癥嚴(yán)重度增加，miR-16表達(dá)量也逐漸降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，一般膿毒癥組相對(duì)于其他組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，嚴(yán)重膿毒癥組與膿毒性休克組之間也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.003)。本研究也同時(shí)測(cè)定了8例革蘭氏陰性菌膿毒癥患者的miR-16表達(dá)水平，結(jié)果顯示其表達(dá)水平顯著升高(圖2，組1)。

為探究miR-16表達(dá)與CRP和PCT之間的關(guān)聯(lián)性，本文也進(jìn)行了兩者的趨勢(shì)分析。經(jīng)過(guò)非參數(shù)Spearman分析，miR-16與CRP和PCT的相關(guān)系數(shù)分別為-0.561和-0.769，表明miR-16與CRP和PCT值存在負(fù)相關(guān)性(圖3)。

圖1 不同年齡段健康受試者的miR-16表達(dá)水平Fig.1 Expression of miR-16 in healthy subjects of different ages

1組：革蘭氏陰性菌膿毒癥患者組；2組、3組和4組分別代表金黃色葡萄球菌一般膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒性休克組Group 1: Sepsis group with gram-negative bacterial infection; Group 2,group 3 and group 4 is the general sepsis group,severe sepsis group and septic shock group with Staphylococcus aureus infection,respectively.圖2 革蘭氏陰性菌和金黃色葡萄球菌膿毒癥患者的miR-16表達(dá)水平分析Fig.2 Expression of miR-16 in gram negative bacteria and Staphylococcus aureus sepsis

圖3 患者miR-16表達(dá)水平與CRP和PCT的相關(guān)性分析Fig.3 Analysis of the correlation between miR-16 expression and CRP and PCT in patients

3 討 論

金黃色葡萄球菌膿毒癥在革蘭氏陽(yáng)性菌中已躍居首位[9]。細(xì)菌膿毒癥的研究目前多見(jiàn)于革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌膿毒癥研究較少，探討該菌膿毒癥相關(guān)機(jī)制具有較大臨床價(jià)值。miRNA可作為感染性疾病診斷和治療的潛在靶標(biāo)[10]，但其產(chǎn)生和致病相關(guān)的機(jī)制尚不清楚。膿毒癥與非感染性全身性炎癥反應(yīng)綜合征區(qū)別的金標(biāo)準(zhǔn)是血培養(yǎng)，但細(xì)菌血培養(yǎng)陽(yáng)性率較低[11]，因此選取合適血清標(biāo)志物對(duì)于膿毒癥輔助診斷較有意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，在金黃色葡萄球菌膿毒癥患者中miR-16表達(dá)水平與膿毒癥嚴(yán)重程度呈明顯負(fù)相關(guān)，各組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與炎癥指標(biāo)PCT和CRP有負(fù)相關(guān)，提示其可作為金黃色葡萄球菌膿毒癥診斷或治療的潛在靶標(biāo)，具有較大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，本文發(fā)現(xiàn)miR-16在革蘭氏陰性菌膿毒癥中表達(dá)水平顯著升高。研究[12]也曾在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)miR-16在膿毒癥患者中相對(duì)于健康對(duì)照組表達(dá)量明顯升高。膿毒癥本質(zhì)上是由病原體感染誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，但其機(jī)制較為復(fù)雜[13]，革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌主要分別存在脂多糖(LPS)和脂磷壁酸(LTA)，兩者在膿毒癥發(fā)病機(jī)制方面會(huì)有所不同[14-15]。為了排除患者生理因素可能影響miR-16表達(dá)，本文選取了不同年齡組的健康受試者進(jìn)行了miR-16水平測(cè)定，結(jié)果顯示miR-16表達(dá)在不同年齡組的健康受試者中沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明患者的生理因素不會(huì)對(duì)miR-16表達(dá)水平造成影響。本文將miR-16表達(dá)水平與相應(yīng)的CRP和PCT測(cè)定值進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)存在明顯的負(fù)相關(guān)性，表明miR-16可潛在作為金黃色葡萄球菌膿毒癥嚴(yán)重程度的分子標(biāo)記物。

miRNA參與膿毒癥誘導(dǎo)性炎癥反應(yīng)信號(hào)通路的作用尚不太清楚，但有證據(jù)顯示Toll樣受體(TLR)家族介導(dǎo)了膿毒癥炎癥發(fā)生[16]，該受體是一種可感知保守性病原體相關(guān)分子(PAMP)的跨膜蛋白。TLR活化時(shí)，其可通過(guò)下游激酶激活NF-κB等促炎因子進(jìn)行炎癥反應(yīng)的調(diào)控[16]。TLR家族在不同類(lèi)別細(xì)菌中作用方式不同，TLR2和TLR4分別被革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌的成份激活[17]。因此，后續(xù)可通過(guò)探討TLR2和NF-κB等信號(hào)通路的激活狀況，進(jìn)一步研究miR-16在金黃色葡萄球菌膿毒癥中的致病機(jī)制。

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Expression level of miR-16 inStaphylococcusaureussepsis and its clinical significance

WANG Jia-xue1,CHEN Yan2,LIU Xiao-xiang3,SUN Ai-hua3, YANG Jun1,LYU Huo-yang4,ZHOU Yong-lie4

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,HangzhouMedicalCollege,Hangzhou310053,China; 2.SpecialWard,ZhejiangTaizhouHospital,Taizhou317000,China; 3.DepartmentofBasicMedicine,HangzhouMedicalCollege,Hangzhou310053,China; 4.TheCenterofClinicalLaboratory,ZhejiangProvincePeople'sHospital,Hangzhou310014,China)

We investigated correlation between the level of miR-16 expression and the severity ofStaphylococcusaureussepsis,and further explored its potentially clinical significance. Blood samples were collected from 32 patients,including each 8 cases of septic shock,severe sepsis and general sepsis,as well as 8 cases of healthy volunteers. Blood samples from 24 cases of healthy subjects with different ages were measured,and additionally 8 cases of blood samples from gram negative bacteria sepsis were also determined in current study as a control. Trizol solution for the whole blood lysis was added into blood samples,and followed by the extraction of microRNA. The expression levels of miR-16 in different groups were measured by fluorescence quantitative PCR,in which 2-Delta Ct method was used. SPSS software (version 13.0) was used to analyze the statistical differences between the groups,and further analyze the correlation between miR-16 value and the corresponding CRP and PCT values. Results showed that the expression level of miR-16 was negatively correlated with the severity ofStaphylococcusaureus

sepsis. There were statistically significant differences in experimental groups when compared with the control (P<0.001),and there was also a statistically significant difference between each experimental group (P<0.01). We found that the expression level of miR-16 was negatively correlated with CRP and PCT,the correlation coefficients were -0.561 and -0.769 respectively,and trend analysis showed that there was a significantly negative correlation. A significantly negative correlation was found between the miR-16 expression level and severity of sepsis,suggesting that miR-16 may serve as a biomarker for the severity ofStaphylococcusaureussepsis.

miR-16;Staphylococcusaureus; sepsis

Sun Ai-hua,Email: sunah123@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.008

浙江省自然科學(xué)基金(LY16H190006)；國(guó)家自然科學(xué)青年基金(31501581)；浙江省教育廳一般科研項(xiàng)目(Y201534394)；浙江醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)?？茖W(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015XZA02)。

孫愛(ài)華，Email: sunah123@126.com

1.杭州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，杭州 310053； 2.浙江省臺(tái)州醫(yī)院特需病區(qū)，臺(tái)州 317000； 3.杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，杭州 310053； 4.浙江省人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，杭州 310014

R378.1

A

1002-2694(2017)05-0427-05

2016-08-29 編輯：張智芳

Supported by Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No. LY16H190006),the National Natural Science Foundation of China (No. 31501581),the Scientific Research Foundation of Zhejiang Provincial Department of Education (No. Y201534394),and the Scientific Research Plan Project of Hangzhou Medical College (No. 2015XZA02)