新疆吉木薩爾地區大蒜根腐病病原菌的分離與鑒定

張麗娟，王瑋，謝玉清，張志東，顧美英，朱靜，唐琦勇，王博，宋素琴

(新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091)

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新疆吉木薩爾地區大蒜根腐病病原菌的分離與鑒定

張麗娟，王瑋，謝玉清，張志東，顧美英，朱靜，唐琦勇，王博，宋素琴

(新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091)

【目的】研究新疆吉木薩爾大蒜種植區大蒜根腐病的病原菌。【方法】采用常規組織分離法分離純化病原菌，用傳統的形態學鑒定方法，結合分子生物學方法對菌株進行鑒定。用原位傷根法進行回接，對照科赫法則明確致病菌的種類及其致病力。【結果】在采集的3批次典型病害植株組織和根際土壤中分離得到64株分離物，其中61株分屬于鐮刀菌，分屬于尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌、芳香鐮刀菌、三線鐮刀菌、輪狀鐮刀菌和木賊鐮刀菌。尖孢鐮刀菌和層生鐮刀菌分離頻率累計達到76.6%，且在采集的各個時期都有分離出現。選取典型的5株菌株進行回接測定，回接的5個鐮刀菌種均表現出不同程度的致病性，其中尖孢鐮刀菌是大蒜根腐病分離頻率最高、且致病性最強的致病菌，其次為層生鐮刀菌。【結論】新疆吉木薩爾地區大蒜根腐病是由鐮刀菌屬的真菌引起的，其中尖孢鐮刀菌是致病的優勢種。

大蒜；根腐病；尖孢鐮刀菌；致病性

0 引 言

【研究意義】新疆是中國傳統四大名蒜“新疆白皮蒜”的原產地。新疆大蒜的種植主要集中在天山北坡逆溫帶的吉木薩爾、奇臺、木壘以及焉耆、塔城等地。吉木薩爾地區的“綠嘴白皮蒜”，以其皮薄瓣勻、口感辛辣、耐貯存等優良品質，在市場上占有一定份額。近年來，大蒜價格居高不下，產量供不應求，促使大蒜的種植規模在不斷擴大。在連作、管理不善、種質退化以及氣候條件不利等原因的影響下，大蒜的病蟲害也呈現高發趨勢。在吉木薩爾大蒜種植區自2012年以來出現大蒜根腐型病害，該病害作用時間長、發病范圍廣、防治較為困難、危害也最為嚴重[1]。但至今對該地區大蒜根腐病病原菌系統的研究尚未見報道。研究大蒜根腐病病原菌的種類及其優勢種，有利于深入研究病害的發生機理和發病規律，對該病害的科學防治具有重要意義。【前人研究進展】作物的根腐病是一類發病原因復雜，防止極為困難的土傳病害。根腐病往往由多種病原菌混合侵染造成，例如牡丹根腐病病原菌是茄腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、鏈格孢菌(Alrernariaspp.)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等，同時茄腐皮鐮刀菌也是甜瓜、黃瓜、苜蓿等作物的根腐病病原菌[2,3]。草莓的根腐病病原菌主要是絲核菌(Rhizoctoniaspp.)、鐮刀菌(Fusariumspp.)和輪枝菌(Verticliliumspp.)等[4-6]。Carlucci等[7]認為球殼屬真菌(Sphaerulina)是造成意大利園藝作物根腐病的主要病原。桑紫紋羽病菌(Helicobasidiummompa)是韓國紫云英根腐病的主要病原菌[8]。2006和2007年邳州、徐州、陜西興平、武功蒜區發生大蒜根腐病，病害大蒜產量和質量明顯下降。根據相關報道，張博等[9]研究認為該病害主要由腐霉菌引起，而劉留和李程玉等[10,11]則認為該病害由細菌引發。可見，不同地區大蒜根腐病的發病原因和病原菌也不盡相同。在新疆，已報道有根腐病發生的作物有在大豆、花蕓豆、加工辣椒、番茄、苜蓿、雪蓮、棉花、甜瓜和小麥等，根腐病已經給新疆農業生產帶來了巨大的損失。【本研究切入點】近年來，吉木薩爾地區大蒜根腐病呈現高發趨勢，給蒜農造成極大經濟損失，成為當前制約新疆大蒜生產的主要因素之一。目前尚未有關于該地區大蒜根腐病病原、發病規律及病害防治的相關報道。研究新疆吉木薩爾大蒜種植區大蒜根腐病的病原菌。【擬解決的關鍵問題】研究吉木薩爾地區大蒜根腐病典型病害樣本，并進行病原菌的分離鑒定，明確該病的致病菌種類及優勢致病菌，為新疆大蒜種植區大蒜根腐病的科學防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

病原菌分離用的大蒜采自吉木薩爾新地鄉大蒜連作田。分別于2013年8月、2014年8月、2015年8月分3批次采樣挖取，篩選具有典型根腐病性狀的蒜株，置于保鮮袋內4℃，送回實驗室后立即進行病原菌分離。

培養基：PDA培養基(馬鈴薯葡萄糖培養基/potato dextrose agar )：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15～20 g，水1 000 mL。121℃滅菌20 min。WA(2%水瓊脂培養基)自來水1 000 mL，瓊脂20 g。121℃滅菌20 min。SNA培養基(Spezieller N?hrstoffarmer 瓊脂培養基)KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KNO31 g，KH2PO41 g，蔗糖0.2 g，葡萄糖0.2 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL。121℃滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離純化

將患病大蒜植株尤其是根系在流水下沖洗干凈。采用常規組織分離法切取不同時期采集的大蒜病株患病部位的病健交界部分，大小為5 mm×5 mm。表面消毒：首先用75%乙醇浸泡30 s，然后用HgCl2浸泡30 s，無菌水沖洗3次，置于PDA平板上，28℃培養3 d。

取鑒定為鐮刀菌屬的培養物的菌落邊緣，置于SNA培養基上，促進鐮刀菌產孢。待孢子產生后，制備孢子懸液用單孢分離法在WA板上獲得純化培養物。純化后的菌株用PDA斜面，4℃保存。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態學

將純化后的菌株分別置于PDA、WA和SNA培養基上，28℃，培養4 d后測量PDA培養基上的菌落直徑，計算生長速度，10 d后分別觀察3種培養基上的菌落菌絲形態和顏色。顯微鏡下觀察孢子及產孢結構，以及厚垣孢子的有無、大小、形態等特征。參照《真菌志》、《真菌鑒定手冊》、《常見鐮刀菌鑒定手冊》，進行形態學鑒定。

1.2.2.2 分子生物學

分離得到的典型菌株在PDA平板上培養10 d左右，刮取收集菌絲，利用CTAB法提取基因組DNA。采用真菌通用引物 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行擴增。PCR反應體系為：2×Mix25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O至50 μL。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸50 s，35個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，DNA片段經膠回收試劑盒回收測序，測序結果與GenBank登錄的鐮刀菌屬及相近屬的序列進行比對分析。

1.2.3 分離菌株的致病性測定

根據分離菌株的分類鑒定結果，選取代表性的菌株YF2-1，YF2-4，YF2-6，YF2-19，YF2-34，YF3-2，YF4-2接種于PDA液體培養基中28℃，160 r/min震蕩培養7 d，紗布過濾除去菌絲體，濾液5 000 r/min離心10 min得到孢子懸浮液。用無菌水稀釋至1×106個孢子/mL。

病原菌回接采用傷根法。接種前適當澆水保持基質濕潤，用玻璃棒在距幼苗根莖約2 cm處扎一個孔，小心暴露出幼苗的部分根莖，用無菌刀片在根須處制造一個小傷口，將25 mL孢子懸液灌入孔內，對照組接無菌的PDA培養液。每個菌株至少3次重復。觀察接種后的發病情況。

根據科赫法則，對發病植株進行病原菌的再次分離。根據發病程度制定5級分級標準，統計發病情況和病情指數。

0級：植株完整健康，根系健康，蒜頭健康表皮紅，無發病。

1級：植株健康，根系健康，蒜頭尚且健康但表皮變黑，莖基部變黑。

2級：植株葉子變黃，根系較弱，蒜頭小且表皮變黑，莖基部變黑，略軟腐。

3級：植株矮小，葉子變黃；根系短小軟腐，蒜頭小，變黑軟腐，莖基部軟腐嚴重。

4級：植株死亡，根系腐爛，蒜頭極小或者無蒜頭

發病率=發病株數/調查總株數×100%.

×100.

2 結果與分析

2.1 病原菌的種類及分離頻率

在大蒜的生長周期，分三個時期采集典型的根腐病蒜株。在患病大蒜的根際土壤樣本中分離得到24株分離物，其中鐮刀菌22株。在根腐病大蒜植株樣本中，共分得分離物40株，其中鐮刀菌39株，同時對比患病蒜株根際土壤中分離得到的真菌培養物(分離物24株，其中鐮刀菌22株)，表明鐮刀菌可能是造成吉木薩爾大蒜根腐病的主要病原菌。表1

2.2 鐮刀菌種的鑒定

通過菌株在不同培養基上的培養性狀、孢子及產孢結構形態大小等特征，參照真菌鑒定手冊，參考Lester[12]和John等[13]關于鐮刀菌的形態學描述，將61株鐮刀菌鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)、芳香鐮刀菌(Fusariumredolens)、三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)、木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)和輪狀鐮刀菌(Fusariumverticillioides)。各個種所占的比例分別是：51.6%、25%、7.8%、6.2%、3.1%、1.6%。圖1，圖2，表1，表2

表1 大蒜根腐病病原物分離

Table 1 Isolates from the root rot diseaed garlic plants and rhizosphere soil samples

Isolates根際土 Rhizospheresoil病組織 Diseasedtissue分化期Differentiationstage抽薹期Bultingstage成熟期Maturestage分化期DifferentiationStage抽薹期Bultingstage成熟期Maturestage菌株數Numberofstrains分離頻率Occurrencefrequency(%)尖孢鐮刀菌F．oxysporum81510453351 6層生鐮刀菌F．proliferatum410111625木賊鐮刀菌F．equiseti1123 1芳香鐮刀菌F．redolens2357 8輪狀鐮刀菌F．verticillioides111 6三線鐮刀菌F．tricinctum12146 2葡萄潰瘍病菌B．dothidea1白地霉G．candidum1毛霉M．circinelloides1

通過提取DNA，通用引物擴增ITS序列測序分析，序列長度在500 bp左右，與NCBI數據庫進行比對，發現菌株YF2-1與層生鐮刀菌F.proliferatumstrain H10序列一致性最高，為99%。菌株YF2-19與芳香鐮刀菌F.redolensstrain E306序列一致性最高，達到99%。菌株YF2-4與尖孢鐮刀菌F.oxysporumM102H序列同源性達到99%。菌株YF3-2 、YF4-2與尖孢鐮刀菌F.oxysporumisolate Fol-km序列一致性較高，達到99%。圖3

表2 典型菌株菌落及孢子形態

Table 2 Morphological characteristics of typical fungal isolates

菌株YF2-1StrainYF2-1菌株YF2-4StrainYF2-4菌株YF2-19StrainYF2-19菌株YF3-2StrainYF3-2菌株YF4-2StrainYF4-24d菌落直徑(mm)Colonydiameterafter4days50×5535×3941×4730×3434×38菌落形態Colonymorphologies氣生菌絲羊毛狀，疏松。正面白色，反面紫色。分生孢子少。氣生菌絲菌絲絮狀，疏松。正面白色，背面白色。孢子粉狀，大量。氣生菌絲絮狀，致密。正面白色，背面淺粉色。孢子粉狀，大量。丁香花味。氣生菌絲絮狀，疏松。正面白色，背面淺粉色。孢子大量，粉狀。氣生菌絲絮狀，致密。正面白色，背面棕黃色。孢子呈灰黃色，粉狀，大量。大分生孢子Macroconidium長而直，兩端略彎，舟形，3～5隔。細長，鐮刀形，近安剖瓶形。有3～5隔。粗壯，紡錘形。多為3隔，偶有4隔。細長，鐮刀形，少許彎曲，多數3隔細長，少許彎曲，鐮刀形或新月形，3～5隔。小分生孢子Microconidium鏈生或假頭生。卵形或棒槌形，無隔。假頭生。紡錘形或者長橢圓形。0～1隔。假頭生，單胞，棒槌形，偶有隔。假頭生，卵形，單胞假頭生，卵形，單胞瓶梗類型Phialides單瓶梗或“Z”形復瓶梗單瓶梗或“Z”形復瓶梗單瓶梗或“Z”形復瓶梗單瓶梗或“Z”形復瓶梗單瓶梗或“Z”形復瓶梗厚壁孢子Clamydospore無頂生或間生，球形。頂生或間生，球形。頂生或間生，球形。頂生或間生，球形。

注：A:菌落正面；B:菌落反面

Note：A: positive; B: back

圖1 典型病原分離物在PDA平板上的菌落形態

Fig.1 Morphological characteristics of conidiospores and chlamydospores of typica fungal colonies isolated from root rot garlic plant tissues on PDA plate

注：A:YF2-1 B-C:YF2-4 D-E:YF2-19 F-G:YF3-2 H-I:YF4-2

Note：A:YF2-1 B-C:YF2-4 D-E:YF2-19 F-G:YF3-2 H-I:YF4-2

圖2 典型病原分離物分生孢子與厚垣孢子的顯微形態(放大倍數10×40)

Fig.2 The micromorphology of typical fungal isolates from the root rot diseased garlic on PDA plate (magnification10×40)

圖3 基于ITS序列分析的菌株YF2-1、YF2-4、YF2-19、YF3-2、YF4-2的系統發育樹狀圖

Fig.3 Phylogenetic tree of strain YF2-1、YF2-4、YF2-19、YF3-2、YF4-2 based on rDNA ITS sequence cluster analysis

2.3 病原菌的致病性測定

研究表明，大蒜根腐病在每年的5月底6月初開始出現，發病初期根部及莖基處表皮褐變軟腐，嚴重時根系腐爛變黑。發病較輕的幼苗地上部分無明顯癥狀，但隨著生長和侵害的加重，患病植株長勢逐漸變弱，地上部分發育不良，嚴重時蒜頭極小，甚至整株萎蔫死亡。連作和自留種情況下發病更為嚴重。

對分離得到的菌株合并去重，選取典型的菌株進行回接實驗。接種后植株的長勢變弱，地上部分退黃萎蔫，莖基處接種點出現病斑，與田間自然發病的癥狀相似。通過對接種幼苗的再分離、培養形狀和病原形態學觀察，接種病原菌的發病幼苗均再次分離得到與接種菌一致的菌，證明回接選取的5株菌都是大蒜根腐病的病原菌。

盆栽幼苗接種病原菌30 d后，YF2-1、YF2-4、YF2-19處理組長勢明顯弱于接種PDA的CK組。接種后50 d，處理組YF2-1開始出現病死株。田間回接的病情調查結果表明，回接的5株菌都有一定的致病性，可以導致典型的大蒜植株莖基及根系褐變腐爛，其中尖孢鐮刀菌致病性最強，其次為層生鐮刀菌、芳香鐮刀菌。圖4，圖5，表3

表3 大蒜根腐病病株分離物致病性測定

Table 3 Comparison of the pathogenicity ofFusariumspp.

接種病菌SpeciesofFusarium發病率Percentsofinfection(%)病情指數Diseaseindex層生鐮刀菌YF2-1F．proliferatumYF2-17064 3尖孢鐮刀菌YF2-4F．oxysporumYF2-49069 4芳香鐮刀菌YF2-19F．redolensYF2-196066 7尖孢鐮刀菌YF3-2F．oxysporumYF3-27050尖孢鐮刀菌YF4-2F．oxysporumYF4-26070 8

3 討 論

研究從新疆大蒜主產區的大蒜根腐病樣品中分離得到鐮刀菌61株，通過形態學和分子生物學鑒定為尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌、芳香鐮刀菌、三線鐮刀菌、輪狀鐮刀菌和木賊鐮刀菌。從分離結果可以看出，患病植株的根際土壤中真菌的種類也趨向于單一化，主要以鐮刀霉菌尤其是尖孢鐮刀菌為主。病害樣本組織中分離得到的優勢菌是尖孢鐮刀菌和層生鐮刀菌。在分化期，雖然根腐病尚未集中爆發，地上部分多數還沒呈現出典型的褪綠變黃、植株萎蔫狀態，但此時植株幼苗尚小，對病菌的抵抗力也比較弱，比較容易受到侵染，因此，分得的病菌數量也較多。而幼苗時期即感病的植株，在后續的生長過程中會發生比較嚴重的根腐癥狀，多數植株在生長后期死亡，因此，幼苗期感染造成的危害也比較嚴重。通過調查發現連作方式和自留種都會加重病害的發生，這可能是由于連作障礙以及種子帶菌導致的。

在大蒜的整個生長時期兩類樣本中都能夠分得尖孢鐮刀菌，這可能預示著尖孢鐮刀菌是該病害的主要致病菌。研究選取了5株典型的病原分離物YF2-1、YF2-4、YF2-19、YF3-2、YF4-2進行原位傷根回接。YF2-1、YF2-4、YF2-19分離自分化期病樣組織，YF3-2分離自抽薹期病樣組織，YF4-2分離自成熟期病樣組織。回接后盆栽和田間試驗都表現出典型的根腐病癥狀，在發病植株組織中重新分得回接的菌株，表明這5株菌都有一定的致病性。因此，新疆大蒜的根腐病是由多種鐮刀菌復合侵染造成的。實驗選取的典型尖孢鐮刀菌YF2-4、YF3-2、YF4-2不僅在各個生長期病樣組織中都能分離得到，并且具有較高的侵染性，是吉木薩爾地區大蒜根腐病的優勢致病菌。

鐮刀霉菌是作物根腐病的主要致病菌。鐮刀菌感染導致的根腐病在香蕉[14]、大豆[15、16]、三七[17]、掌葉大黃[18]、黃芪[19]、枸杞[20]、煙草[21]等多種作物上都有發生。根據報道，僅在新疆地區，就已經發生過鐮刀菌引起的加工辣椒[22]、甜瓜[23、24]、紅棗[25]、苜蓿[26]、花蕓豆[27]、加工番茄[28]和大豆根腐病[16]。此次，也明確了發生在新疆大蒜作物上的根腐病致病菌是鐮刀菌。

此外，在分離過程中出現鐮刀菌屬以外的毛霉等菌株，經分析并非致病菌，這可能有分離過程中病害組織表面土壤清理、消毒不徹底有關。分離過程中，發現部分病株上有蒜蛆出現，蟲害的發生使植株完整程度受損，根系分泌物增多，抑制了土壤中有益菌群的繁殖，在一定程度上加重了病害的發生。根腐病是現階段新疆大蒜種植中的主要病害之一。該病發病時間早，范圍廣，持續時間長，化學防治困難，直接影響大蒜的產量和品質。研究表明，大蒜根腐病是一種由多種病原菌引起的復雜的土傳病害，因此，傳統的田間防治缺乏針對性和有效性。在研究的基礎上，引入病蟲害生物防治為主的綠色、無公害的田間栽培管理技術，減少并控制病害的發生，實現“綠色植保”。

注：A：對照組 B-F:實驗組YF2-1，YF2-4，YF2-19，YF3-2，YF4-2；H-I:典型癥狀

Note：A-C: experiment group YF2-1，YF2-4，YF2-19，YF3-2，YF4-2; D：control group H-I: typical field symptoms

圖4 盆栽試驗中病原菌回接后出現的典型的根腐病癥狀

Fig.4 The typical field symptoms of garlic root rot disease after the pathogen inoculation

in pot experiment

注：A-C:回接發病； D-F:自然發病

Note：A-C:artificial infection; D-F: natural infection

圖5 病原菌回接后出現的典型的根腐病田間癥狀

Fig.5 The typical field symptoms of garlic root rot disease after the pathogen inoculation in field trial

4 結 論

新疆吉木薩爾地區大蒜根腐病正是由鐮刀霉菌引起的一類土傳病害。在分離得到的病原菌中選取典型的菌株回接，尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌和芳香鐮刀菌都有一定致病性，其中尖孢鐮刀菌在蒜的各個生長階段的病害樣本中都能分離得到，且分離頻率最高，致病性也最強，是大蒜根腐病的優勢致病菌，其次是層生鐮刀菌。

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Supported by: Supported by Natural Science Foundation of Xinjiang "Isolation and identification of the pathogens causing garlic root rot in Xinjiang and the dynamic analysis of pathogenesis" (2014211B033)

Isolation and Identification of the Pathogens Causing Garlic Root Rot in Jimsar

ZHANG Li-juan, WANG Wei, XIE Yu-qing, ZHANG Zhi-dong, GU Mei-ying,ZHU Jing, TANG Qi-yong, WANG Bo, SONG Su-qin

(ResearchInstituteofAppliedMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalScience/ .XinjiangLaboratoryofSpecialEnvironmentalMicrobiology,Urumqi830091,China)

【Objective】 In order to provide a scientific basis for the prevention and control of garlic root rot disease in Xinjiang, potential pathogens were isolated and identified from root garlic tissues. 【Method】Using conventional tissue separation method for the separation and purification of pathogenic bacteria of the strains were identified by traditional morphological identification method combined with molecular biological methods. The method of in situ root injury was used to control the species and pathogenicity of pathogenic bacteria by contrast with Koch's postulate. 【Result】64 isolates were purified from 3 batches root rot samples in Jimsar County, in which 61species were finally identified as theFusariumspp.F.oxysporum,F.proliferatum,F.tricinctum,F.redolens,F.verticillioides,F.equisetiwere involved in this disease.F.oxysporumandF.proliferatumcould be isolated from all growth stages with frequency of 76.6% in total. In situ pathogenicity tests demonstrated that 5 typical strains could cause the infection of root rot at different levels, and the major pathogen wasF.oxysporum, followed byF.proliferatum. 【Conclusion】Different species ofFusariumspp. are involved in garlic root rot in Xinjiang.F.oxysporumwas considered as the dominant pathogen because of its wide distribution, high frequency of isolation and strong pathogenicity.

garlic; root rot;Fusariumoxysporum; pathogenicity

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.04.018

2017-02-07

新疆維吾爾自治區自然科學基金項目“新疆大蒜根腐病病原菌分離鑒定及發病規律動態分析”(2014211B033)

張麗娟(1986-)，女，山東德州人，助理研究員，碩士研究生，研究方向為微生物學，(E-mail)kindzhanglijuan@aliyun.com

S436.33

A

1001-4330(2017)04-0725-10