德國鳶尾組培快繁過程中內生菌的分離、鑒定及控制藥劑篩選

韓宏偉，廖晴，瑪爾哈巴·吾斯滿，王浩，莊紅梅，王強，沙紅

(新疆農業科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

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德國鳶尾組培快繁過程中內生菌的分離、鑒定及控制藥劑篩選

韓宏偉，廖晴，瑪爾哈巴·吾斯滿，王浩，莊紅梅，王強，沙紅

(新疆農業科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

【目的】在德國鳶尾的組培過程中，內生菌引起的污染制約著其進行快速繁殖工廠化育苗，針對引起德國鳶尾組培苗污染的內生菌進行分離、鑒定，研究比較6種常用藥劑對該菌株的抑制效果，篩選出最佳防治藥劑，為德國鳶尾組培快繁過程中有效控制內生菌污染提供科學依據。【方法】采用NA培養基分離純化菌株(115325)，通過形態特征觀察、生理生化試驗及16S rDNA序列同源性分析，對其進行分類鑒定。采用紙碟抑菌圈法測定6種常用藥劑對供試菌株的抑制效果。【結果】供試菌株115325的形態特征，及生理生化指標與表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)基本相同。16S rDNA序列分析表明，該菌株與解糖葡萄球菌S.saccharolyticus(L37602) 進化關系最為密切，聚在同一個系統發育分支，與表皮葡萄球菌的同源性最高，為99.86%。室內藥劑篩選結果表明，頭孢菌素和慶大霉素對供試菌株的抑制作用最強。【結論】綜合形態學特征、生理生化特性及 16S rDNA 序列分析結果，供試菌株115325被鑒定為表皮葡萄球菌。頭孢菌素和慶大霉素可作為抑制德國鳶尾組培苗內生菌污染的首選藥劑。

德國鳶尾；內生菌；組織培養；鑒定；控制藥劑

0 引 言

【研究意義】德國鳶尾是一種多年生宿根花卉，其花色艷麗而豐富，花姿奇特，且適應性強，是園林綠化、美化，花壇、草坪裝飾的優良材料。我國德國鳶尾種苗多從國外引進，數量少，有很多品種不能形成種子，分株繁殖率較低，通過組織培養快速繁殖是盡快滿足應用需求的最為有效的途徑[1]。在德國鳶尾組培快繁過程中發現，經過多代培養后，苗叢基部慢慢會出現細菌感染，呈現鼻涕狀菌落，并向外蔓延，甚至有些會擴展到組培苗嫩葉上，后期逐漸褐化枯萎死亡，嚴重影響德國鳶尾組培苗的快繁生產。研究通過分離、鑒定引起德國鳶尾組培苗污染的內生菌，篩選出控制該病原菌的最有效藥劑，為有效控制德國鳶尾組培快繁過程中內生菌的污染提供技術保障。【前人研究進展】 植物內生菌(Endophyte)是指存活于健康植物組織內部，而又不引發宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物類群，主要包括真菌、細菌和放線菌[2]。關于植物組織培養過程中內生菌的污染已有很多報道，如金線蓮(Anoectochilusroxburghii)組培中內生菌污染率達到 50%[3]，仙客來(Cyclamenpersicum)的塊莖組織內生細菌污染率達83.0%[4]，地黃(Rehmanniaglutinosa)由于有內生細菌的存在污染率達 100%等[5]。從已有的報道看，被鑒定的內生菌種類主要有：黃單胞菌屬(Xanthomonas)[6]、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)[7]、假單胞屬(Pseudomonas)[8]、 土壤桿菌屬(Agrobacterium)[9]、葡腸桿菌屬(Enterobacter)、棒桿狀菌屬 (Corynebacterium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、短小桿菌屬(Curtobacterium)[10]、歐文氏菌屬(Erwinia)[11]等。【本研究切入點】有關德國鳶尾組織培養過程中內生菌污染的問題，未見相關文獻報道。研究通過對德國鳶尾組培快繁過程中的內生菌進行分離與鑒定，比較幾種食品添加劑和抗生素對該內生菌株的抑制效果，篩選出抑制效果最好的藥劑，為德國鳶尾組培快繁過程中有效控制內生菌污染提供科學依據。【擬解決的關鍵問題】研究分離鑒定出在德國鳶尾組培快繁過程中的內生菌種類，篩選出最有效的控制藥劑，為有效控制德國鳶尾進行快速繁殖工廠化育苗中內生菌污染提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試材料

供試材料為引進的德國鳶尾受內生菌污染的組培苗。

1.1.2 培養基及試劑

用NA培養基分離和培養供試內生菌株，用LB培養基搖培，蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂粉、酵母粉等配制培養基所用試劑均為國產分析純。細菌基因組 DNA 快速提取試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司，細菌16S rDNA通用引物 (27F/1492R) 、2×TaqPCR MasterMix等試劑購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 內生菌的分離純化及控制藥劑篩選1.2.1.1 內生菌分離純化

挑取受污染的德國鳶尾組培苗培養基上的菌苔，劃線接種到NA培養基上，挑取單菌落連續純化3代后，接種到液體LB培養基中，37℃恒溫，200 r/min搖培6 h，用于基因組DNA提取及拮抗藥劑篩選。

1.2.1.2 控制藥劑篩選

采用紙碟抑菌圈法測定供試藥劑的抑菌效果。將搖培過夜的供試內生菌菌懸液以1%的體積比加入冷卻至40～50℃的加瓊脂粉的NA培養基中，迅速搖勻后倒平板；用打孔器將濾紙打成直徑大小一致的紙片，分別浸入到配好的不同濃度的供試藥劑中，充分浸濕以后貼入到已倒好的含菌培養基平板上，4℃恒溫擴散5 h，37℃恒溫靜置培養24 h，測量抑菌圈的直徑，每個處理設3次重復。

1.2.2 形態特征、生理生化指標測定

光學顯微鏡下觀察供試菌株個體形態特征，并通過測定供試菌株D-葡萄糖產酸、麥芽糖產酸、L-阿拉伯糖產酸等糖發酵試驗、還原硝酸鹽、水解淀粉、溫度生長適應性、pH適應性及對氯化鈉的耐受性等生理生化指標,以《常見細菌鑒定手冊》及《伯杰氏細菌鑒定手冊》[12]為依據對供試菌株進行鑒定。

1.2.3 16S rDNA序列分析

細菌基因組DNA提取用天根TIANamp Bacteria DNA Kit(離心柱型)，方法參考說明書。16S rDNA-PCR反應體系(25 μL)：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，模板1.0 μL(20 ng左右)，引物27F/1492 R (10 μmol/L)各1.0 μL，用滅菌雙蒸水補足至25 μL。正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′；反向引物1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′[13]。擴增條件:95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72 ℃ 90 s, 共30個循環；72℃延伸10 min； 4℃ 保存。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選清晰且大小合適的條帶進行回收，連接轉化后送生工生物(上海)股份有限公司測序。轉化載體為pEASY?-T5 Zero Cloning Vector,反應條件參考pEASY?-T5 Zero Cloning Kit說明書。

將測序得到的16S rDNA全序列在網上(http://www.ezbiocloud.net/identify)進行同源性搜索，用MEGA 5軟件構建系統發育樹，確定該菌株的系統發育地位。

2 結果與分析

2.1 形態特征觀察及生理生化試驗

研究表明，供試菌株115325(圖1b)在NA培養基上表現為乳白色不透明菌落，有凸起，表面光滑，邊緣整齊；菌體革蘭氏染色為陽性，多球形或稍橢圓形，直徑0.5～1.5 um，排列成葡萄串狀，無鞭毛，不能運動，無芽孢。圖1

a:供試菌株污染的德國鳶尾組培苗；b:供試菌株在NA培養基上的菌落形態

a:Irisgermaica’s cultivation seedling polluted by the strains tested; b: Colony morphologies of the strain 115325 on NA culture medium

圖1 供試菌株的形態學特征

Fig.1 The strains morphology charateristics

生理生化特征測定結果表明，與《伯杰氏細菌鑒定手冊》[12]及《常見細菌鑒定手冊》中描述的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)基本相同，可被鑒定為表皮葡萄球菌。表1

表1 菌株115325部分生理生化指標測定

Table 1 The strains(115325)of physiological and biochemical index determination

測定項目Determinationproject結果Results測定項目Determinationproject結果ResultsD-葡萄糖產酸D-dextrose+Maltose+蔗糖產酸Canesugar+NaCl耐受性NaClgrowth2%+7%+10%+L-阿拉伯糖產酸L-Arabiacandy-淀粉水解Starchhydrolysis-pH值pHvalue5 0營養肉湯5．0nutrientbroth+8 2營養肉湯8．2nutrientbroth+利用乳糖Lactose-山梨醇產酸Sorbitol-還原硝酸鹽Nitratereduction+木糖產酸Xylose-甘露醇厭氧產酸Mannitolanaerobic-棉子糖產酸Raffinose-利用蛋白胨Peptone+A蛋白Aprotein-利用牛肉浸膏Beefextract+甘油Glycerinum+核糖醇Ribitol+

注：+：陽性反應；-：陰性反應

Note：+: Positive reaction; -: Negative reaction

2.2 16S rDNA序列分析

以供試菌株115325的基因組DNA為模板，用16S rDNA通用引物(27F/1492R)PCR擴增，得到了大小1.5 Kb左右的片段(圖2c)，回收純化后(圖2d)，連接轉化到pEASY?-T5 Zero Cloning Vector上，PCR鑒定陽性克隆(圖2e)。圖2

c: 供試菌株16S rDNA擴增結果；d:回收產物；e:陽性克隆鑒定

c: 16S rDNA PCR;d:recycled product;e:positive cloning identification

圖2 供試菌株16S rDNA純化

Fig.2 The strains of 16S rDNA purification

16S rDNA序列同源性比較分析參考劉紹雄[14]等的方法，將測序所得序列拼接后輸入網站(http://www.ezbiocloud.net/identify)進行同源性搜索，獲取與供試菌株16S rDNA序列同源性較高的部分菌株序列，構建系統發育樹，供試菌株115325與解糖葡萄球菌S.saccharolyticus(L37602)聚在同一個系統發育分支，進化關系最為密切。同源性比對結果表明，供試菌株16S rDNA序列與表皮葡萄球菌S.epidermidis(L37605)同源性最高，達99.86%，與S.saccharolyticus(L37602)的同源性為99.38%。系統發育分析與序列同源性比對結果不一致，但綜合生理生化特征分析，供試菌株115325可被鑒定為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。表2，圖3

2.3 控制藥劑篩選

研究表明，6種供試藥劑對供試菌株115325均有抑制作用，苯甲酸鈉和山梨酸鉀隨著處理濃度的增加，抑制效果減弱，相同濃度處理下，苯甲酸鈉的抑菌效果好于山梨酸鉀。慶大霉素、硝酸銀、卡那霉素和頭孢菌素隨著處理濃度的增加，抑菌效果增強，同為1.0 mg/L濃度處理下，頭孢菌素對供試菌株的抑菌圈最大，直徑為19.91 mm，卡那霉素和硝酸銀的抑菌圈直徑分別為9.54和2.05 mm。表3

注：括號中的序號為 GenBank 登錄號；分支點上的數字為自展值百分比

Note：GenBank accession numbers are shown in the parentheses;The number at each branch point is the percentage supported by bootstrap

圖3 基于16S rDNA序列的系統發育樹

Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

表2 用于構建系統發育樹的菌株相關信息

Table 2 Related information of strains used for building phylogenetic tree

菌株名稱Strainname菌株編號Strainnumbers登錄號Accession同源性Similarity(%)StaphylococcusepidermidisATCC14990L3760599 86StaphylococcuscapraeATCC35538AB00993599 46StaphylococcussaccharolyticusATCC14953L3760299 38Staphylococcuscapitissubsp．capitisATCC27840L3759999 32Staphylococcuscapitissubsp．urealyticusGTC727AB23332599 17Staphylococcuspetrasiisubsp．petrasiiCCM8418JX13984598 71StaphylococcuswarneriATCC27836L3760398 70StaphylococcussimiaeCCM7213AY72753098 64StaphylococcusargenteusMSHR1132FR82177798 64StaphylococcusschweitzeriFSA084CCEL0100002598 57Staphylococcusaureussubsp．anaerobiusATCC35844D8335598 57Staphylococcuspetrasiisubsp．pragensisNRL/St12/356KM87366998 57Staphylococcusaureussubsp．aureusDSM20231AMYL0100000798 51Staphylococcuspetrasiisubsp．croceilyticusCCM8421AY95314898 51Staphylococcushominissubsp．hominisDSM20328X6610198 50StaphylococcushaemolyticusATCC29970L3760098 50StaphylococcuslugdunensisATCC43809AB00994198 44StaphylococcuschromogenesATCC43764D8336097 56

表3 供試藥劑及其抑菌效果測定

Table 3 Supplied test fungicides and bacteriostatic effect determination

藥劑名稱Fungicides處理濃度與抑菌圈直徑(mm)TreamentcontentandBacteriostaticcirclediameter苯甲酸鈉Sodiumbenzoate0 01mol/L0 05mol/L0 1mol/L10 667 787 98山梨酸甲Potassiumsorbate0 01mol/L0 05mol/L0 1mol/L9 263 762 86慶大霉素Gentamicin0 05ml/L0 1ml/L0 2ml/L11 3112 8216 34硝酸銀Silvernitrate0 1mg/L0 4mg/L1 0mg/L0 181 012 05卡那霉素Kanamycin1 0mg/L5mg/L10mg/L9 5414 6116 40頭孢菌素Cephalosporin1 0mg/L5mg/L10mg/L19 9121 1623 42

3 討 論

Leifert等[15]研究表明，外植體培養在3～5 d后才出現的細菌菌落，可能是內生菌引起的污染。在對德國鳶尾進行組織培養時發現，常常在培養10 d左右時才出現類似細菌的污染，因此推測可能是由內生菌引起的。一般來講，在種的分類上，如果兩個分類單位間的16S rDNA 序列同源性大于97.5%，可視為與模式菌株同種[16-17]。研究中供試菌株115325的16S rDNA序列與表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的同源性最高，為99.86%，而與解糖葡萄球菌(Staphylococcussaccharolyticus)的系統發育地位最為密切，序列同源性為99.38%。綜合生理生化指標測定結果，最終將供試菌株115325鑒定為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。因此，在對細菌進行分類時，尤其是在近緣種的分類鑒定上，基于16S rDNA序列的系統發育分析存在著一定的局限性，需將細菌生理生化特征測定與現代分子生物學有效結合起來，才能得出更加可靠的結論，這與劉紹雄[14]等的結論是一致的。

研究鑒定的引起德國鳶尾組培苗污染的內生菌，即表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)為人和動物體內的條件致病菌[18]，在動物皮膚、腸道等器官中大量存在。因此，出現內生菌的污染可能與研究所選擇的德國鳶尾組織培養外植體的生長環境有關，如施用農家肥等。

研究6種常用的防止細菌污染的食品添加劑(苯甲酸鈉、山梨酸鉀)和抗生素(慶大霉素、卡那霉素和頭孢菌素)對供試菌株的抑制效果，認為頭孢菌素(先鋒霉素)和慶大霉素可作為抑制德國鳶尾組培苗內生菌污染的首選藥劑，這與韓美麗[19]等在綠巨人(Spathiphyllumkochii)組織培養中研究了青霉素鈉、先鋒霉素和慶大霉素對繼代培養中細菌污染的抑制效果，結果表明，先鋒霉素的抑制效果最好，青霉素和慶大霉素次之。與細菌的結論是一致的。研究發現，隨著苯甲酸鈉和山梨酸鉀處理濃度的增大，其對供試菌株的抑制效果卻在減弱，其原因有待于進一步探索。

4 結 論

供試菌株115325與表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的16S rDNA 序列同源性最高，達到了99.86%，綜合形態特征觀察、生理生化指標測定及分析, 可將其鑒定為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。6種常用藥劑對供試菌株115325的抑制效果差異顯著，研究表明，在1.0 mg/L濃度處理下，頭孢菌素對供試菌株的抑菌圈最大，直徑為19.91 mm，慶大霉素0.2 ml/L處理下的抑菌圈直徑達到16.34 mm。因此，頭孢菌素(先鋒霉素)和慶大霉素的抑制效果最好，可作為抑制德國鳶尾組培快繁過程中內生菌污染的首選藥劑。

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Isolation, Identification and Screening of Endophyte Fingicides for Disease Control during Tissue Culture of German Irises

HAN Hong-wei, LIAO Qing , Marbaha Wsman, WANG Hao,ZHUANG Hong-mei, WANG Qiang, SHA Hong

(ResearchInstituteofHorticulturalCrops,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 During tissue culture of German irises, Endophytic bacteria pollution is the key problem of restricting them for rapid propagation factory nursery. For that reason, this project aims to segregate and identify endophytic bacteria that might lead to tissue culture explants pollution, and the inhibition of 6 kinds of commonly used agents on the strain effect will be compared so as to select the best preventive agent. That will provide a scientific basis for effective control of endophytic bacteria pollution during its rapid propagation. 【Method】The strain (115325) has been segregated and purified using NA medium and the endophytic bacteria were been classified and identified by morphology observation, physiological and biochemical test, and 16S rDNA sequence homology analysis. Inhibitory effects of 6 kinds of commonly used chemicals on the tested strains were determined by the method of paper disc bacteriostatic circle. 【Result】The strain (115325) of morphology characteristics and physiological and biochemical indicators were basically the same asStaphylococcusepidermidis. The results of 16S rDNA sequence homology analysis showed that the strain andsaccharolyticus(L37602) had mostly close relation in the evolution, belonging to the same phylogenetic branch. AndS.staphylococcusepidermidishad the highest homology, at 99.86%. Indoor medicament screening results showed that the cephalosporins and gentamicin had the strongest inhibitory effect on strains. 【Conclusion】The comprehensive analysis results of morphological characteristics, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence, 115325 strains have been identified asStaphylococcusepidermidis. Cephalosporin and gentamicin can be used as the preferred agents to inhibit endophytic bacterial contamination of the German iris plantlets.

German irises; endophytes; tissue culture; identification; disease control agent

LIAO Qing(1962-)，Associate Professor，Bachelor of Agriculture，Ornamental horticulture, (E-mail)lq08270029@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.04.009

2016-12-06

新疆維吾爾自治區科技支疆項目“鳶尾新品種引進、繁殖技術開發及園林應用示范”(201591118)

韓宏偉(1986-)，男，河南人，助理研究員，研究方向為蔬菜花卉栽培，(E-mail)hhwei2010@sohu.com

廖晴(1962-)，女，四川安岳人，副研究員，研究方向為園藝觀賞學，(E-mail)lq08270029@sina.com

S681.9

A

1001-4330(2017)04-0652-08

Supported by: Supported by Xinjiang Uyghur Autonomous Region's science and technology programs "The introduction of new varieties of iris, reproduction technology development and application demonstration garden" (201591118)