新疆薰衣草多倍體誘導研究

廖晴，瑪爾哈巴·吾斯滿，沙紅，高燕，龔松旺，廖志立

(1.新疆農業科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆霍城縣農業技術推廣站，新疆霍城 835200)

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新疆薰衣草多倍體誘導研究

廖晴1，瑪爾哈巴·吾斯滿1，沙紅1，高燕1，龔松旺2，廖志立1

(1.新疆農業科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆霍城縣農業技術推廣站，新疆霍城 835200)

【目的】通過對新疆薰衣草主栽品種C-197優選優株的組培苗進行多倍體植株誘導，并對誘導成功的多倍體植株進行快繁體系的建立，探討新疆薰衣草種質資源創新技術的有效途徑，為新疆薰衣草產業提供種質資源創新技術支撐。【方法】采用新疆薰衣草C-197優選優株的組培苗為材料，接種至多倍體誘導培養基 MS+1 mg/L 6-BA+2% DMSO(二甲基亞砜)+不同濃度的秋水仙素中,進行多倍體誘導，比較在不同濃度的秋水仙素中，處理不同時間產生多倍體的差異，確定適合誘導新疆薰衣草C-197多倍體秋水仙素的濃度及處理時間。【結果】新疆薰衣草C-197優選優株的無菌苗，接種于MS+1 mg/L6-BA+2%二甲基亞砜+0.2%～0.4%秋水仙素的誘導培養基上處理48～72 h，均可使新疆薰衣草C-197的無菌苗產生多倍體。【結論】運用新疆薰衣草C-197多倍體誘導的試驗方法，可快速實現對新疆薰衣草多倍體植株的新品種選育，縮短育種周期，有效提高和推進新疆薰衣草優質種苗的培育速率及種質創新。

新疆薰衣草C-197；秋水仙素；誘導；多倍體

0 引 言

【研究意義】薰衣草是新疆特色經濟花卉之一。據統計，我國每年消耗薰衣草精油70 t左右，其中2/3是新疆生產的，目前我國對薰衣草精油的需求量以每年15%以上遞增。我國薰衣草雖有幾十年的栽培歷史，栽培技術已相對完善，但栽培品種卻嚴重退化混雜，生產量及質量在逐年下降，因而對薰衣草種質資源的創新已迫在眉睫。薰衣草是異花授粉植物，由于該群體的復雜異質性，選擇優良個體進行常規繁殖，優良性狀是很難穩定遺傳的。為了獲得性狀更優異的新品種，對新疆主栽品種C-197進行多倍體育種，為薰衣草種質創新奠定堅實的基礎。【前人研究進展】國外對薰衣草育種一直都很重視，除傳統的常規育種外，還積極地進行基因工程和多倍體育種研究。我國對薰衣草精油的提取工藝、薰衣草的栽培管理技術等，都有較深入的研究工作。但在薰衣草的育種技術研究及優良品種的繁殖技術研究方面，開展的研究工作甚少[1-2]。尤其在新疆受經濟條件的制約，育種及優質種苗生產嚴重滯后，極大地限制了精油生產的深層次發展。【本研究切入點】目前對新疆薰衣草C-197進行優選優株的選擇并進行多倍體育種的研究未見報道。針對目前新疆薰衣草產業亟待解決的種質混雜問題，通過生物技術手段，快速對提純的優選優株組培苗進行多倍體誘導，進而有效提高和推進新疆薰衣草優質種苗的培育速率及種質創新。【擬解決的關鍵問題】研究通過優選優株的組培快繁，提純薰衣草品種的種質，在良好的種質基礎上，通過誘導多倍體進行種質創新，解決目前新疆薰衣草產業中栽培品種嚴重退化混雜，生產量及質量在逐年下降的問題。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗以新疆薰衣草主栽品種C-197的優選優株的組培苗為試材。

1.2 方 法

1.2.1 多倍體誘導

用新疆薰衣草C-197優選優株的組培苗，剪取粗細均勻且帶兩個莖節的莖段，接種至多倍體誘導培養基 MS+1 mg/L 6-BA+2% DMSO(二甲基亞砜)+不同濃度的秋水仙素(0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)中，每個處理接45個莖段， 處理不同時間(24、48、72 h)后，轉接到MS+1 mg/L 6-BA+0.3 mg/LIBA繼代培養基上，每天光照12 h，光照強度為1 600～2 000 lx,培養溫度24～28℃。

1.2.2 多倍體純化

培養25 d后，再轉接在MS+1 mg/L 6-BA+0.3 mg/LIBA繼代培養基上，如此反復培養多次，培養純合體，去除嵌合體，得到純化的多倍體苗。從中選擇變異明顯的穩定植株進行鑒定。

1.2.3 多倍體鑒定

1.2.3.1 外部形態觀測

形態學變化是多倍體最直觀的鑒定方法[3-4]。多倍體植物的外部形態特征與二倍體相比往往表現出生長勢強，植株更加強健，葉片大而厚、葉表皺縮粗糙、顏色變深等，根據以上特征對處理后變異的植株進行初步篩選。葉片大小、厚度及莖粗可用游標卡尺測量，葉綠素含量是用SPAD-502型葉綠素測定儀，在植株上均勻地取3片葉，測定其葉綠素含量的平均值。

1.2.3.2 葉片氣孔觀測

摘取葉片肥大具有顯著多倍體植株葉片特征的葉片下表皮進行制片，在顯微鏡下觀察測量氣孔的大小，以氣孔的顯著增大與否及氣孔密度是否顯著減小作為進一步篩選鑒定多倍體的指標[5]。

1.2.3.3 流式細胞儀鑒定

以誘導存活的薰衣草各處理的純化多倍體組培苗為材料，切取50 mg嫩葉置培養皿中，加入萃取裂解緩沖液(15 mmol/ Tris-HCl，pH 7.5，80 mmol/L KCl，20 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA-Na-2，15 mmol/L巰基乙醇0.05 (V/V )TritonX-100)，快速切碎并使碎片完全浸于萃取液中，避光靜置萃取2～5 min，200目尼龍網過濾，離心(1 000 r/min)漂洗3次，制備的細胞核懸浮液離心后棄上清液，獲得單細胞懸浮液[6-7]。用流式細胞儀測試該樣品倍性的 DNA含量峰值圖，以正常植株作對照，將對照出現峰值的地方作為基準，檢測變異株，觀察其出現峰值的地方偏移程度。

2 結果與分析

2.1 秋水仙素對材料的誘導

采用不同濃度秋水仙素及不同時間處理的薰衣草莖段，研究表明，變異率隨著處理時間和濃度的變化而變化，處理時間越短，秋水仙素濃度越低，加倍率越低；處理時間延長，秋水仙素濃度增加，加倍率隨之增加，但材料的死亡率也更高。0.2%～0.3%的秋水仙素處理48～72 h產生變異的效果較好,而0.2%的秋水仙素處理48 h誘變頻率高達60%，0.5%秋水仙素處理死亡率過高，藥害明顯，低于0.05%誘變頻率幾乎為零。用0.2%的秋水仙素處理48 h的薰衣草莖段的變異率最高。因此，該條件下的誘導效果最好。表1

2.2 多倍體的穩定

用秋水仙素誘導的多倍體中有純合體和嵌合體。由于嵌合體產生的變異細胞生活力較弱、分裂速度慢，而正常二倍體細胞生活力強、分裂快，嵌合體如果不經過分離穩定則會產生回復突變，最后變成正常的二倍體。試驗選取變異明顯的植株，切段后轉接在MS+1 mg/L 6-BA+0.3 mg/LIBA繼代培養基上，如此反復培養多次，培養純合體，可得到純化的多倍體苗。從中選擇變異明顯的穩定植株進行鑒定，經檢測多倍體植株表現出高度的穩定性。

表1 秋水仙堿的不同濃度和不同處理時間誘導四倍體植株變化

Table 1 Effect of colchicine at different concentration and different long time on tetraploid induction

秋水仙素濃度(%)Colchicinesconcentration處理時間(h)Treatingtime處理株數Numberoftreatedplants死亡數Numberofdeadplants死亡率(%)Deathrate變異數Numberofvariation變異率(%)Variationrate0 01244872151515001006 670000000 05244872151515021013 336 67001006 670 124487215151501206 6713 33020013 3300 22448721515151126 676 6713 3329713 336046 670 324487215151503402026 6727713 3346 6746 670 424487215151538132053 3386 673522033 3313 330 5244872151515915156010010050033 3300

2.3 多倍體的鑒定

以新疆薰衣草C-197的優選優株的組培苗的葉片、莖尖、植株為對照，進行檢測。

2.3.1 外部形態觀測

在相同的培養條件下，對薰衣草C-197誘導的多倍體植株與對照植株進行外部形態觀察比較，差異表現為：經秋水仙素處理獲得的薰衣草多倍體出現葉片增大、肥厚，顏色深綠，植株粗壯，植株的生長速度明顯增快；研究表明，變異植株葉片及植株明顯大于對照植株。薰衣草多倍體葉片厚度、寬度、長度分別是二倍體的157.14%、173.93%、131.38%，莖粗、葉綠素含量分別是二倍體的213.21%、182.01%；方差分析結果表明，四倍體與二倍體葉片厚度、長度和寬度、莖粗及葉綠素含量均達到極顯著差異，因此，用葉片的大小、莖粗及葉綠素含量可作為鑒別多倍體與二倍體的重要指標。表2，圖1，圖2

2.3.2 氣孔鑒定

取植株形態有變化的植株與對照植株的葉表皮，用光學顯微鏡觀察氣孔，研究表明，形態有變化的植株與對照植株相比，表皮氣孔直徑明顯增大且單位面積內的氣孔數明顯減少 ，可確定變異植株為多倍體。圖3，圖4

圖1 A為對照植株葉片，B 為變異植株葉片

Fig.1 A:control plant leaves,B: variation plant leaves

圖2 A為對照植株，B為變異植株

Fig.2 A:control plant,B:variation plant

表2 變異植株與對照植株外部形態及葉綠素含量比較

Table 2 External form of polyploid compared with diploid plant

樣品Sample葉Leaf(mm)厚 Thickness寬 Bladewidth長 Engthofleaf莖粗(mm)Stemdiameter葉綠素含量SPADChlorophyllcontent對照植株 Controlplant0 21Bb2 57Bb5 13Bb0 53Bb15 01Bb變異植株 Variationplant0 33Aa4 74Aa6 74Aa1 13Aa27 32Aa

注：表中數據后的大、小寫字母表示顯著水平為0.01和0.05

Note:The Large and owercase letters after the data mean that the significant level is 0.01 and 0.05

圖3 對照植株

Fig.3 Control plant

圖4 變異植株

Fig.4 Variation plant

2.3.3 流式細胞儀鑒定

以新疆薰衣草C-197的組培苗植株的葉片為對照,對變異株的新鮮幼嫩葉片進行細胞DNA含量測定，研究表明，對照植株葉片的DNA含量的主峰熒光強度為64(圖5)；變異植株(圖6)所示：植株的葉片DNA含量的主峰熒光強度為96，是對照植株的非整數倍，可確定為嵌合體，在用秋水仙素誘導多倍體時，這種非整數倍占大多數；而變異植株(圖7)所示：植株的葉片DNA含量的主峰熒光強度為128，為對照的兩倍，即可確定為純合的多倍體植株。圖5～7

圖5 對照植株DNA含量分布

Fig.5 The DNA content distribution of Control plants

圖6 變異植株DNA含量分布

Fig.6 The DNA content distribution of variation plants

圖7 變異植株DNA含量分布

Fig.7 The DNA content distribution of variation plants

3 討 論

薰衣草的良種繁育及種質創新要通過良種篩選才得以實現，而良種篩選需要建立科學的篩選規程。在我國尚未建立薰衣草品種篩選體系和標準的情況下，研究通過對薰衣草主栽品種C-197的株型、花期、產花量等性狀進行調查，選擇出優選優株，并對優選優株進行組培快繁。在優質種苗快繁過程中，對C-197的優選優株進行了多倍體的誘導試驗。試驗結果表明：誘導薰衣草的秋水仙素濃度要適宜，不宜過低或過高，過低不能達到使植株產生變異的效果；過高會使植株產生生理性病害，同一濃度下處理的時間太短，對植株影響比較小，變異率也比較低；處理時間過長，也會對植株產生藥害，表現為植株干尖、植株褐化、死亡等癥狀，由此可見，影響誘導薰衣草多倍體的關鍵條件是秋水仙素濃度及處理時間。

用秋水仙素誘導的多倍體中嵌合體占的比例比較大。由于嵌合體產生的變異細胞生活力較弱、分裂速度慢，而正常二倍體細胞生活力強、分裂快，嵌合體如果不經過分離穩定則會產生回復突變，最后變成正常的二倍體。在分離的過程中，要不斷的去除那些變異小的及不能分化出正常植株的變異體，把變異大的，且能夠分化出正常植株的變異體進行繼代培養，一般培養5～6代以上，才能得到純化的多倍體植株。有關嵌合體(非整數倍體)在誘導中所占比例、什么樣的嵌合體更易于變為多倍體(整數倍體)等問題還有待于今后繼續進行探究。

多倍體的鑒定可從植株的外部形態、葉片表皮氣孔的大小、密度及葉綠素含量來判定[3-12]，經秋水仙素處理獲得的薰衣草多倍體出現葉片增大、肥厚，顏色深綠，植株粗壯，植株生長速度明顯增快的特征。因此，葉片的大小、莖粗及葉綠素含量等可作為鑒別多倍體與二倍體的重要指標。在誘導薰衣草多倍體的過程中，尤其是在多倍體組培植株的純化操作中，運用外部形態、葉片表皮氣孔的大小、密度及葉綠素含量來判斷多倍體或采用流式細胞儀對多倍體植株進行快速鑒定更為簡單、方便和快捷。在實際工作中，無需先去進行染色體鑒定該植株是幾倍體，只要知道是已加倍的植株，就可以先進行新品種的篩選，待該植株已被選擇為新品種，再進行染色體鑒定的倍性確認。這樣既能減少工作量，又能節省工作過程中大量的人力、物力及時間投入，更高效地選育出新的品種，再利用組培快繁技術提高變異植株的繁殖速率，不僅可縮短多倍體育種年限，而且可使新品種在短時期內迅速的運用于生產。

4 結 論

用0.2%～0.4%的秋水仙素對新疆薰衣草C-197的組培苗進行誘導處理48～72 h，均可使新疆薰衣草C-197的組培苗產生多倍體，0.2%的秋水仙素處理48 h誘變頻率高達60%，但許多誘導出的多倍體并非都是正常的多倍體植株，而有相當部分是嵌合體(非整數倍體)，所以要進行多次反復的繼代，使誘導出的多倍體植株純化后，再通過觀測組培苗外部形態及氣孔大小、氣孔密度、或用流式細胞儀等方法進行初期的倍性鑒定，待選育的多倍體植株已被選擇為新品種時，再進行染色體鑒定的倍性確認。該試驗方法可更高效地選育出新的品種，并且利用組培快繁技術提高變異植株的繁殖速率，不僅可縮短多倍體育種年限，而且可使新品種在短時期內迅速的應用于生產，進而可有效提高和推進新疆薰衣草優質種苗的培育速率及種質創新。

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Preliminary Study on Polyploid Induction of Xinjiang Lavender

LIAO Qing1, Marhaba Wsman1, SHA Hong1, GAO Yan1, GONG Song-wang2, LIAO Zhi-li1

(1.ResearchInstituteofHorticulturalCrops,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.HuochengCountyAgriculturalTechnologyExtendingStationsofXinjiang，HuochengXinjiang835200,China)

【Objective】 The polyploid plants will be induced by tissue culture seedlings of C-197, which is the main cultivar of Xinjiang lavender, and the rapid propagation system of polyploid plants will be established, the research aims to explore the effective ways of Xinjiang lavender germplasm resources innovation technology and provide the technical support for the Xinjiang lavender industry. 【Method】The optimal strains of C - 197 tissue-cultured plantlets were taken as the testing material, polyploid plants were induced on polyploid induction medium MS+1 mg/L 6-BA+2% DMSO + different concentrations of colchicine. Different time treatments causing polyploidy in different concentrations of colchicines were compared, thus determining the suitable concentration and time for C-197 polyploid colchicine concentration and treatment time. 【Result】Xinjiang lavender C-197 optimum strains of aseptic seedlings can make its seedlings to produce polyploid after 48-72 h explanted on induction medium MS+1 mg/L6-BA+2% DMSO +0.2%-0.4% colchicines. 【Conclusion】Using the test method of inducing polyploid plants from tissue-cultured plantlets of optimal strains of C-197 can quickly realize the lavender polyploid plant new variety breeding, shorten the breeding period, improve and promote the Xinjiang lavender quality seedlings breeding rate and germplasm innovation work.

Xinjiang lavender C-197; colchicine; induction; polyploid

LIAO Qing(1962-), Associate Professor, Bachelor of Agricalture, ornamental horticultare

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.04.008

2017-02-07

新疆維吾爾自治區公益性科研院所基本科研業務費專項項目“新疆特色經濟花卉薰衣草資源的種質優化”(KY2014033)

廖晴(1962-)，女，四川安岳人，副研究員，研究方向為園藝觀賞學，(E-mail)lq08270029@sina.com

S573+9

A

1001-4330(2017)04-0645-07

Supported by: Special Funded Projects of public welfare scientific institution in Xinjiang Uygur Autonomous Region "Xinjiang characteristic economy flowers lavender germplasm optimization of resources" (KY2014033)