穩定同位素內標/超高壓液相色譜-串聯質譜法同時測定水果與豆芽中10種植物生長調節劑殘留

劉柏林，謝繼安，趙紫微，王秀莉，單曉梅

(安徽省疾病預防控制中心，安徽 合肥 230601)

穩定同位素內標/超高壓液相色譜-串聯質譜法同時測定水果與豆芽中10種植物生長調節劑殘留

劉柏林*，謝繼安，趙紫微，王秀莉，單曉梅

(安徽省疾病預防控制中心，安徽 合肥 230601)

建立了水果與豆芽中10種植物生長調節劑殘留的超高壓液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)分析方法。以酸化乙腈(1∶1 000，體積比)為提取液，樣品經高速勻漿與超聲輔助分散提取后，提取液采用固相萃取柱凈化，甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液為流動相，梯度洗脫，電噴霧電離，正負離子掃描，多反應監測模式(MRM)檢測，基質匹配同位素內標標準曲線定量。最優條件下，10種植物生長調節劑殘留在0.1～50.0 μg/L濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.995，檢出限為0.2 μg/kg，平均回收率為52.4%～119.6%，相對標準偏差(RSD)均小于13%。該方法樣品前處理簡單、凈化效果好，同位素內標的使用解決了基質效應及前處理過程中待測物損失造成定量結果不準確的問題，適用于大批量果蔬中多種植物生長調節劑的快速測定。

超高壓液相色譜-串聯質譜法；植物生長調節劑；同位素內標；水果；豆芽

植物生長調節劑( Plant growth regulator,PGRs) 是一類人工合成的農藥，具有與天然植物激素相似的生理和生物學效應,有促進植物生長，或延緩、抑制功能[1]，能夠提高作物產品質量和品質、增強果實抗病力、延緩果實成熟等作用。隨著植物生長調節劑在農業方面的廣泛使用，其毒性與危害引起了人們的關注。研究表明，殘留在農作物中的植物生長調節劑可通過食物鏈進入人體，輕者造成腹瀉等疾病，重者使人體免疫力下降，骨骼疏松，甚至有致畸、致癌、致突變等嚴重后果[2]。

針對植物生長調節劑殘留問題，國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission,CAC)、美國、歐盟、日本、澳大利亞等組織和發達國家相繼制定了最大殘留限量標準(Maximum residue limits,MRLs)[3-4]。在中國，隨著“毒豆芽”與“爆炸西瓜”事件的發生，植物生長調節劑的安全性受到廣泛關注，現行有效的國家標準GB2763-2014中制定了2，4-二氯苯氧乙酸、多效唑、氯吡脲、噻苯隆的最大殘留限量。但植物生長調節劑種類繁多，在最大殘留限量制定方面均不完善，分析方法的研究顯得尤為重要。當前，植物生長調節劑的檢測方法主要有高效液相色譜法[5]、液相色譜-質譜聯用法[6-12]、氣相色譜-質譜聯用法[13-14]。其中液相色譜-質譜聯用法以其抗干擾能力強、靈敏度高,并能提供結構方面的信息確證而被更多采用[6]，而已報道的液相色譜-質譜聯用法大多使用基質外標法定量，很少有同位素內標法定量的報道[15]。對基質復雜的蔬菜、水果樣品，基質效應是存在的。解決基質效應的最好方法是基質加標或同位素內標法，而基質加標法需制備工作曲線，一般很難找到合適的空白本底的基質樣品。采用同位素內標法很好克服了這一缺點，降低了基質效應的影響，避免了待測物在樣品前處理過程中的損失，從而保證了測定結果準確可靠。

本文建立了UPLC-MS/MS 同位素內標法同時測定水果與豆芽中10種植物生長調節劑殘留的分析方法。通過對色譜條件、質譜條件、樣品前處理進行優化，同位素內標法進行校正，使得本方法靈敏度高、準確性好，適合于大批量水果與蔬菜樣品中多種植物生長調節劑的同時測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AcquityTMUPLC超高壓液相色譜儀、串聯質譜儀(ZEVO TQ MS)、8010G樣品均質杯均購自美國Waters公司；VORTEX Gnius 3旋渦混勻器(德國IKA公司)；MCS固相萃取柱、SLC固相萃取柱(500 mg，6 mL，杭州福裕科技服務有限公司)。

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D，純度≥99.0%)、脫落酸(純度≥98.5%)、吲哚乙酸(純度≥99.5%)、吲哚丁酸(純度≥99.9%)、赤霉素(純度≥94.7%)、4-氯苯氧乙酸(純度≥99.5%)、氯吡脲(純度≥99.0%)、噻苯隆(純度≥99.5%)、6-芐基腺嘌呤(純度≥99.0%)、多效唑(純度≥99.5%)購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；2，4-二氯苯氧乙酸-d5(純度≥98.5%)、吲哚乙酸-d7(純度≥99.2%)、氯吡脲-d5(純度≥98.7%)購自加拿大C/D/N Isotopes公司；甲醇、甲酸、乙腈、氨水(色譜純,德國Merck公司)；乙酸銨(色譜純,Sigma公司)。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液：分別取適量的標準物質及同位素內標物質，用甲醇溶解，并定容至刻度，配制成100 μg/mL的標準儲備液，避光保存于-20 ℃冰箱；混合標準工作液：準確移取適量標準儲備液至容量瓶中，用10%甲醇水溶液稀釋至刻度，混勻，配制成100 ng/mL的混合標準工作液；準確移取適量同位素內標標準儲備液至容量瓶中，用10%甲醇水溶液稀釋至刻度，混勻，配制成100 ng/mL的混合內標工作液，現配現用。

1.3 超高壓液相色譜(UPLC)條件

色譜柱:Waters AcquityTMUPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；柱溫:40 ℃；樣品室溫度10 ℃；進樣體積:10 μL；流動相:A為5 mmol/L乙酸銨，B為甲醇；流速:0.3 mL/min；梯度洗脫條件：0 ～1 min，0～2%B；1～2 min，2%～30%B；2～4 min，30%～95%B；4～5 min，保持95%B；5～6 min，95%～2%B；6～8 min，保持2%B。

1.4 質譜條件

離子源:電噴霧離子源；電離模式:ESI+和 ESI-；檢測方式:多反應監測(MRM)；毛細管電壓:3.8 kV(ESI+)和2.4 kV(ESI-)；離子源溫度:150 ℃；脫溶劑氣溫度:500 ℃；脫溶劑氣流量:800 L/h；碰撞氣流量:0.13 mL/min。待測物的母離子、子離子及對應的碰撞能量、錐孔電壓見表1。

表1 10種待測物及同位素內標的質譜參數Table 1 MS/MS conditions for the analysis of ten analytes and internal standards

*quantitation ion

1.5 樣品處理

提取：稱取樣品 5.00 g(精確至0.01)于50 mL離心管中，加入500 μL混合內標工作液、20 μL甲酸和20 mL乙腈，高速旋渦混勻1.0 min后，超聲 5 min,冷卻，10 000 r/min離心 5 min，上清液轉移至新的50 mL 離心管中，然后加入 2.0 g NaCl(使其飽和有結晶)，旋渦混勻 2 min后于 10 000 r/min離心5 min，吸出2.0 mL乙腈置于試管中，50 ℃下用氮氣吹干，加入0.2 mL甲醇旋渦溶解，再加入 3.0 mL 40 mmol/L鹽酸溶液混勻，轉移至離心管內于10 000 r/min離心5 min，分出上清液凈化。

凈化：先用5 mL甲醇、 5 mL水、5 mL 40 mmol/L的鹽酸溶液活化 MCS柱，活化結束后，將上清液轉移至MCS柱內，待樣品通過后，用 5 mL水淋洗除雜，真空抽干5 min，依次加入5 mL甲醇、5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集于10 mL具塞試管內，50 ℃下氮氣吹干，加入0.13 mL甲醇超聲溶解殘留物，再加入0.87 mL 純水混勻，過0.22 μm濾膜后待測。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

分別將10種植物生長調節劑配成濃度為1.0 μg/mL的標準溶液，使用Waters TQ MS自動調諧分析，正、負離子模式下進行全掃描,確定10種待測物的母離子及錐孔電壓,在此錐孔電壓下，選取強度較高的兩個子離子分別作為定量和定性離子，以MRM模式優化碰撞能量等質譜參數，定性、定量離子和質譜參數見表1。赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸、噻苯隆、6-芐基腺嘌呤、氯吡脲、吲哚乙酸、吲哚丁酸在正負離子模式下均有響應，但吲哚乙酸、吲哚丁酸與氯吡脲在負離子模式下的離子強度低于正離子模式下。綜合考慮各待測化合物的靈敏度和基質干擾程度，除氯吡脲、多效唑、吲哚乙酸、吲哚丁酸選用正離子模式外，其余待測物均選擇負離子模式。

2.2 流動相的優化

比較了不同流動相對待測物峰形及離子化效率的影響。結果表明，甲醇作為有機相時，各待測物的響應較好,離子強度高,離子化效率優于乙腈。當水相中加入0.1%甲酸時，負離子的離子化效率受到抑制，加入0.01%氨水時，吲哚乙酸與吲哚丁酸的響應降低，而加入乙酸銨緩沖鹽后，待測物分離度增大，峰形尖銳對稱。基于靈敏度的考慮，選擇甲醇作為有機相，5 mmol/L乙酸銨溶液作為水相。10種植物生長調節劑標準溶液及同位素內標的色譜圖如圖1。

2.3 樣品溶劑的優化

考察了不同體積比的甲醇-水溶液作為溶劑溶解樣品時對色譜峰形的影響。實驗表明，純甲醇作溶劑時，與流動相不匹配而產生溶劑效應，待測物的色譜峰展寬最嚴重，甲醇含量降低時，柱效增加，峰形變窄，靈敏度變高。對氮氣吹干后的殘留物進行復溶時，甲醇含量低不能完全溶解殘留在離心管壁上的待測物，導致部分待測物的回收率偏低。綜合考慮，采用13%甲醇作為標準曲線系列的定容溶劑，復溶殘渣時，先加入0.13 mL純甲醇溶解，后加入0.87 mL純水定容，確保定容溶劑中甲醇含量一致。

圖1 基質匹配標準溶液及同位素內標的色譜圖(添加濃度為5.0 ng/mL)Fig.1 Chromatograms of matrix matching and isotope internal standard(5.0 ng/mL)

2.4 樣品凈化的優化

已有文獻多采用分散固相萃取法凈化以達到快速、簡便的目的，但使用分散固相萃取法凈化時，樣品提取液中含有高濃度的有機溶劑，限制了儀器的進樣量，影響靈敏度。另外，分散固相萃取法使用的吸附劑材料取決于待測物的結構，不同的待測物，選取的吸附劑材料不同，檢測植物生長調節劑的吸附劑材料一般為N-丙基乙二胺(PSA)、C18和石墨化炭黑(GCB)，而這些材料吸附的機理不同，除去的雜質也不同。實驗比較了分散固相萃取與陽離子交換柱兩種凈化方法，發現陽離子交換柱凈化能夠更好地除去水果樣品中的色素，增加結果的準確性，避免假陽性。另外，比較了MCS與SLC柱2種混合型的陽離子交換柱的凈化效果，發現吲哚丁酸在SLC柱上沒有保留，經柱凈化后的加標回收率低。因此，本實驗選擇MCS柱凈化樣品，以解決色素殘留問題，提高樣品凈化效果，同時獲得理想的內標回收率，該條件下的平均回收率大于97%。

2.5 內標物的選擇

在質譜檢測中，選取與待測物結構一致的同位素內標進行定量，其定量結果可根據不同基質對待測物響應的抑制進行平行削減，以獲得較高的定量準確性[16]。但同位素內標物的價格較高，種類較少，往往缺乏與待測物結構對應的內標物。本實驗考察了同位素內標校正不同待測物的回收率，最終選取3種氘代同位素內標，其中多效唑、6-芐基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、4-氯苯氧乙酸、吲哚丁酸、赤霉素以氯吡脲-d5作為內標，吲哚乙酸、脫落酸以吲哚乙酸-d7作為內標，2，4-D以2,4-D-d5作為內標。

2.6 基質效應的影響

基質曲線作用在于補償基質抑制和增強效應，基質效應嚴重時會影響定量的準確性。本實驗考察了基質效應的影響，以陰性樣品提取液為溶劑，配制10.0 ng/mL 的混合標準溶液，測定其峰面積為A；以樣品溶劑(13%甲醇)配制10.0 ng/mL的混合標準溶液，測定其峰面積為B，計算基質效應ME(%)=B/A×100，其中ME>100% 說明有基質增強效應，ME<100% 說明有基質抑制效應[17]。由表2可以看出，樣品基質對目標化合物存在一定的影響，除了赤霉素與4-氯苯氧乙酸具有基質抑制效應外，其余化合物均表現為基質增強效應。為提高定量的準確度，本實驗選取陰性樣品的基質提取液作為標準溶液的稀釋液，并加入同位素內標進行校正。

2.7 標準曲線、檢出限與定量下限

選取陰性樣品，按照樣品前處理的步驟進行處理，制備樣品基質提取液，準確移取混合標準工作溶液于容量瓶中，加入500 μL內標混合標準工作液和適量的上述基質提取液，用13%甲醇水溶液定容至刻度，配制成0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/L的標準系列。進樣10 μL分析，以待測物峰面積(y)為縱坐標，質量濃度(x，μg/L)為橫坐標，繪制標準曲線。結果顯示，各待測物均在質量濃度為0.1～50.0 μg/L的范圍內與其峰面積呈良好的線性關系，相關系數均大于0.995(見表2)。

表2 10種待測物的線性方程、相關系數、檢出限、定量下限及基質效應Table 2 Linear equations,correlation coefficients,LODs,LOQs and matrix effects for ten analytes

添加0.2 μg/kg濃度時，10種待測物峰的信噪比(S/N)均大于3，故將其定為檢出限。定量下限定義為在獲得滿意的回收率和相對標準偏差條件下，可以檢測到的樣品溶液中目標化合物的最低濃度，故本方法中10種待測物的定量下限為2.0 μg/kg，方法的靈敏度可滿足GB/T27404-2008實驗室質量控制規范的相關要求。

2.8 精密度與回收率

稱取(5.00±0.01) g陰性樣品，添加混合標準溶液，使加標濃度分別達到1.0，4.0，20.0 μg/kg，加入同位素內標混合液，按照樣品前處理方法進行處理，上機測定，每個添加水平進行5次實驗。結果如表3所示，平均回收率為52.4%～119.6%，相對標準偏差(RSD)為1.0%～12.3%。實際樣品分析發現水果中存在內源性物質脫落酸影響低濃度的測定，加標回收時，適當增加添加量的濃度，可確保結果的準確性，故添加量分別選為10.0，20.0，100.0 μg/kg。

表3 樣品中10種待測物的加標回收率及相對標準偏差(n=5，%)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of ten analytes in the actual samples(n=5，%)

*the additions of abscisic acid were 10.0,20.0，100.0 μg/kg in fruit,and 1.0，4.0，20.0 μg/kg in bean sprout

2.9 實際樣品的測定

采用本方法對超市與農貿市場采集的100份水果、80份豆芽進行測定，水果中植物生長調節劑的檢出率為20.0%，其中葡萄、獼猴桃中的2，4-D、4-氯苯氧乙酸、赤霉素與氯吡脲的檢出率較高，最高濃度分別達到0.041 7，0.033 2，0.021 7，0.041 5 mg/kg。除GB2762-2014規定葡萄與獼猴桃中氯吡脲的最大殘留限值為0.05 mg/kg，葡萄中2，4-D的最大殘留限值為0.1 mg/kg外，水果中4-氯苯氧乙酸和赤霉素尚無限量標準，而獼猴桃中的2，4-D也無限量標準。豆芽中植物生長調節劑的檢出率為38.0%，主要為4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤、赤霉素和吲哚乙酸，檢出值范圍分別為0.006 1～1.01，0.004 3～0.045，0.005 7～0.071，0.006～1.81 mg/kg，這4種待測物在豆芽中均無限量標準，但有文獻報道吲哚乙酸是豆芽內源性生長素[13]，是否屬人為添加還需大量的實驗數據。

3 結 論

本文建立了水果與豆芽中10種植物生長調節劑殘留的UPLC-MS/MS分析方法。與已報道的方法相比，該法采用基質匹配，同位素內標校正，解決了基質效應問題，提高了定量的準確性與可靠性，適合于大批量樣品中植物生長調節劑殘留的快速檢測。

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Simultaneous Determination of Ten Plant Growth Regulator Residues in Fruit and Bean Sprout by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Stable Isotope-labelled Internal Standards

LIU Bo-lin*，XIE Ji-an，ZHAO Zi-wei，WANG Xiu-li,SHAN Xiao-mei

(Anhui Provincial Center for Disease Control and Prevention，Hefei 230601，China)

A method for the determination of ten plant growth regulator residues in fruit and bean sprout by ultra performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS) was established.The samples were extracted by the stirring and ultrasound using formic acid-acetonitrile(1∶1 000),and purified with the solid phase extraction column.The analytes were separated by using methanol-5 mmol/L ammonium acetate as mobile phase.The identifications were achieved by the electrospray ionization in positive and negative mode(ESI+/ESI-) using the multiple reaction monitoring(MRM).The quantifications were performed by the matrix matched isotope-labelled internal standards.Under the optimal experimental conditions,the calibration curves of ten analytes showed good linearities in the concentration range of 0.1-50.0 μg/L with correlation coefficients(r2) above 0.995.Recoveries were between 52.4% and 119.6% with RSDs less than 13.0%.The limits of detection were 0.2 μg/kg.The method had the advantages of simple pretreatment,good purification and low matrix effects,and was suitable for the rapid,high-throughput quantitative analysis of plant growth regulator residues in fruit and bean sprout.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；plant growth regulator；isotope-labelled internal standards；fruit；bean sprout

2016-12-26；

2017-01-23

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.004

O657.63；S143.8

A

1004-4957(2017)05-0601-06

*通訊作者：劉柏林，碩士，主管檢驗師，研究方向：理化分析，Tel:0551-63674883，E-mail：liubolin087@163.com