胸水細(xì)胞塊EGFR基因突變檢測在非小細(xì)胞肺癌中的臨床意義

禹 樂,朱啟淦,楊立民,溫路生,魁國菊,潘羨心,孟加榕(解放軍第175醫(yī)院,廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科,漳州 363000;通訊作者,E-mail:mengjiarong@sina.com)

胸水細(xì)胞塊EGFR基因突變檢測在非小細(xì)胞肺癌中的臨床意義

禹 樂,朱啟淦,楊立民,溫路生,魁國菊,潘羨心,孟加榕*
(解放軍第175醫(yī)院,廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科,漳州 363000;*通訊作者,E-mail:mengjiarong@sina.com)

目的 探討應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測非小細(xì)胞肺癌陽性胸水細(xì)胞塊EGFR突變的臨床意義。 方法 收集具有組織標(biāo)本作為對(duì)照的非小細(xì)胞肺癌陽性胸水60例,制作細(xì)胞塊,提取DNA,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法同時(shí)對(duì)細(xì)胞塊和組織標(biāo)本的EGFR第19外顯子(19-Del)和21外顯子(L858R)突變進(jìn)行檢測,分析細(xì)胞塊與組織標(biāo)本的EGFR突變率的差異。 結(jié)果 胸水細(xì)胞塊中EGFR突變率為35%(21/60),其中19-Del突變11例,L858R突變9例,19-Del和L858R雙突變1例;組織標(biāo)本中EGFR突變率為36.7%(22/60),其中19-Del突變12例,L858R突變9例,19-Del和L858R雙突變1例。兩種標(biāo)本的EGFR突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);胸水細(xì)胞塊EGFR突變類型與其對(duì)應(yīng)的組織標(biāo)本相一致。 結(jié)論 胸水細(xì)胞塊與組織樣本在EGFR基因突變上具有較高的一致性。

肺癌; 胸水; 細(xì)胞學(xué); EGFR基因

目前,肺癌不僅在歐美等發(fā)達(dá)國家居惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率之首[1,2],也已成為我國城市居民死亡率首位的惡性腫瘤,且有逐年上升的趨勢(shì)[3]。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制從細(xì)胞、分子水平的進(jìn)一步認(rèn)識(shí),小分子基因靶向治療藥物EGFR酪氨酸激酶抑制劑在非小細(xì)胞肺癌的治療中取得了顯著效果,有效地延長了患者的生命。但是肺癌缺乏典型的早期癥狀,70%以上的病人在確診時(shí)已屬晚期[4,5],失去了手術(shù)機(jī)會(huì),從而難以獲得用于檢測EGFR基因突變的組織學(xué)標(biāo)本,而胸腔積液是晚期肺癌患者常見的并發(fā)癥之一,標(biāo)本獲取比較容易,本文探索使用非小細(xì)胞肺癌陽性胸水作為檢測EGFR基因突變的一種標(biāo)本來源的可行性,進(jìn)而為晚期伴有胸水的肺癌患者個(gè)體化靶向治療提供分子病理學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本收集

收集2012-01～2016-10廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院具有組織學(xué)標(biāo)本作為對(duì)照的非小細(xì)胞肺癌患者陽性胸水60例,其中男37例,女23例。

1.2 主要試劑與儀器

石蠟樣本DNA提取試劑盒、人類EGFR 基因突變熒光PCR檢測試劑盒均來自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司,免疫組化試劑來自福州邁新公司。Amoydx-Giraffe紫外分光光度計(jì)SMA4000;美國ABI 7500 Real Time PCR System 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 胸水細(xì)胞學(xué)診斷 新鮮送檢的胸水充分震蕩后,取10 ml于試管中以2 000 r/min離心4 min,去除上清液,取沉淀均勻涂片,95%乙醇固定后HE染色,鏡檢選取見到腫瘤細(xì)胞或可疑腫瘤細(xì)胞的標(biāo)本制作細(xì)胞塊。

1.3.2 胸水細(xì)胞塊制作 取胸水12 ml入15 ml尖底離心管,離心機(jī)2 000 r/min,離心5 min,棄上清,如細(xì)胞量過少,可重復(fù)上述步驟,加入4%中性甲醛6 ml,震蕩后靜置30 min,離心后棄上清,轉(zhuǎn)移沉淀至顯微鏡擦鏡紙上,包好后經(jīng)脫水浸蠟制成石蠟細(xì)胞塊。

1.3.3 細(xì)胞塊的病理診斷 按常規(guī)方法制作HE切片,根據(jù)診斷需要選擇免疫組化染色標(biāo)記抗體,采用MaxVisionTM兩步法操作,待病理醫(yī)生診斷后,選取診斷為非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞塊。

1.3.4 石蠟細(xì)胞塊與組織標(biāo)本DNA的提取 以6 μm的厚度分別對(duì)細(xì)胞塊與組織標(biāo)本進(jìn)行切片,并各取10張至1.5 ml離心管中,加入二甲苯1 ml,振蕩混勻10 s,14 000 r/min離心5 min,去上清;加入1 ml無水乙醇,振蕩混勻10 s,14 000 r/min離心5 min,去上清,待乙醇充分揮發(fā)后,按石蠟樣本DNA分離試劑盒(離心柱型)操作步驟進(jìn)行操作獲取樣品DNA提取液。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測EGFR基因突變 應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測 DNA樣品濃度與質(zhì)量,將DNA濃度稀釋至2 ng/μl,取23.5 μl 已稀釋為2 ng/μl待檢DNA樣品,加入1.5 μl Taq酶,將混合好的DNA樣品依次取5 μl加入8連管PCR反應(yīng)體系中,設(shè)立陰性、陽性對(duì)照,進(jìn)入ABI7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中反應(yīng)。循環(huán)條件為95 ℃ 5 min 1個(gè)循環(huán);95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s 15個(gè)循環(huán);93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 20 s 31個(gè)循環(huán)。依據(jù)操作說明書中提供的兩種突變類型的陽性范圍Ct值進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,應(yīng)用χ2檢驗(yàn),比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測胸水細(xì)胞塊與組織學(xué)標(biāo)本的EGFR突變率差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNA含量、質(zhì)量比較

所有樣本所獲取DNA樣本濃度均大于2 ng/μl,OD260/OD280比值范圍在1.6-2.2之間,OD260/OD230比值大于1.6,均符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR要求,胸水細(xì)胞塊與對(duì)應(yīng)的組織標(biāo)本DNA提取液的質(zhì)量相近,DNA的濃度普遍低于組織標(biāo)本(見圖1)。

A．胸水細(xì)胞塊DNA的質(zhì)量和濃度B．組織標(biāo)本DNA的質(zhì)量和濃度圖1 胸水細(xì)胞塊與其對(duì)應(yīng)的組織標(biāo)本DNA提取液的質(zhì)量和濃度對(duì)比Figure1 ComparisonofmassandconcentrationofDNAextractfromcellblockandtissuespecimen

2.2 EGFR基因突變結(jié)果比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:60例胸水細(xì)胞塊發(fā)生EGFR基因突變的為21例(35%),其中19外顯子(19-Del)突變11例,21外顯子(L858R)突變9例,19外顯子(19-Del)和2l外顯子(L858R)雙突變1例;60例組織標(biāo)本中發(fā)生EGFR基因突變的為22例(36.7%),其中19外顯子(19-Del)突變12例,2l外顯子(L858R)突變9例,19外顯子(19-Del)和21外顯子(L858R)雙突變1例。兩種標(biāo)本中EGFR總突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)。

表1 胸水細(xì)胞塊與組織標(biāo)本的EGFR突變結(jié)果的比較

Table 1 Comparison of EGFR mutation results between pleural cell block and tissue specimens

標(biāo)本類型n19Del突變(例)L858R突變(例)19Del和L858R雙突變(例)突變率(%) 細(xì)胞塊60119135 0 組織標(biāo)本60129136 7

2.3 EGFR基因突變類型結(jié)果

除1例組織標(biāo)本檢測結(jié)果顯示為19Del突變而對(duì)應(yīng)的細(xì)胞塊檢測結(jié)果為陰性外,其余的21例細(xì)胞塊EGFR基因突變類型均與其組織標(biāo)本完全一致(見圖2)。

A．L858R突變類型(細(xì)胞塊) B．L858R突變類型(組織標(biāo)本) C．19?Del突變類型(細(xì)胞塊) D．19?Del突變類型(組織標(biāo)本) E．19?Del和L858R雙突變類型(細(xì)胞塊) F．19?Del和L858R雙突變類型(組織標(biāo)本)圖2 胸水細(xì)胞塊EGFR突變與其對(duì)應(yīng)的組織標(biāo)本突變類型一致Figure2 TheEGFRmutationtypesinpleuraleffusionwerethesameasthetissuespecimen

3 討論

非小細(xì)胞肺癌的表皮生長因子受體(EGFR)基因突變情況是使用酪氨酸激酶抑制劑治療的關(guān)鍵指標(biāo),然而臨床中大部分肺癌患者就診時(shí)已經(jīng)是晚期,失去了手術(shù)機(jī)會(huì),用于檢測EGFR基因突變腫瘤組織獲得難度較大。晚期肺癌患者常并發(fā)胸腔積液,15%的初診患者及10%-50%的患者病程中均出現(xiàn)這一癥狀,尤其是外周型腺癌患者[6]。近年來,國內(nèi)孟加榕等[7，8]嘗試使用胸水的上清液、沉淀等不同成分提取DNA,應(yīng)用高分辨率熔解曲線(HRM)技術(shù)檢測EGFR基因突變情況,證實(shí)胸水的上清液、沉淀與腫瘤組織的EGFR基因突變情況具有較高一致性。但HRM是一門新興的技術(shù),國內(nèi)尚未大范圍推廣應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有敏感度高、特異性高、技術(shù)成熟的特點(diǎn),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種基因突變的檢測,但目前國內(nèi)對(duì)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測胸水細(xì)胞塊EGFR基因突變的研究卻鮮有報(bào)道。

有效地提取腫瘤細(xì)胞DNA是進(jìn)行分子檢測的前提,我們對(duì)本組研究所獲取的DNA樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),同一患者的胸水細(xì)胞塊提取的DNA液質(zhì)量與組織標(biāo)本相近,濃度卻普遍略低。這可能是由于胸水中的腫瘤細(xì)胞數(shù)量相較于組織標(biāo)本中的偏少,在制作細(xì)胞塊的過程中又經(jīng)過福爾馬林溶液的固定處理,造成核酸與蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),增加了核酸提取的難度,浸蠟和包埋的過程會(huì)進(jìn)一步造成核酸片段化,加劇核酸的甲基化修飾,降低了提取DNA的獲得率。檢測結(jié)果顯示血性胸水細(xì)胞塊的DNA提取液的濃度相較于其組織標(biāo)本差距最為明顯。除上述原因以外,還有可能是因?yàn)檠孕厮泻写罅康募t細(xì)胞,在離心后占據(jù)了沉淀絕大部分,切取相同數(shù)量的蠟片時(shí)腫瘤細(xì)胞含量就會(huì)相對(duì)偏少,導(dǎo)致在相同條件下提取的DNA濃度偏低。但所有待檢樣本的DNA提取原液均需要稀釋到濃度為2 ng/μl的工作液,這樣可以消除DNA提取原液濃度的差異所帶來的影響。總體上所有樣本DNA提取液的質(zhì)量和濃度均符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測要求,同時(shí)也印證了郭以河等[9，10]所介紹的胸水腫瘤細(xì)胞DNA提取的方法是切實(shí)可行的,實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和所獲得的DNA提取液的質(zhì)量是有保證的,從而為下一步應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測EGFR基因突變提供了必要的前提條件。

目前已發(fā)現(xiàn)不下于30種EGFR基因突變,現(xiàn)有的資料[11-15]表明,EGFR總突變率在20%-45%,其中外顯子19、21突變占到EGFR總突變率的85%-90%。從本次應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,EGFR外顯子19、21發(fā)生突變率為35%,這與上述相關(guān)報(bào)道較一致。除1例組織標(biāo)本檢測結(jié)果顯示為19-Del突變而對(duì)應(yīng)的細(xì)胞塊檢測結(jié)果為陰性外,其余的19例胸水細(xì)胞塊EGFR基因突變的數(shù)據(jù)和組織學(xué)標(biāo)本完全一致,突變均為21例,其中19外顯子(19-Del)突變11例,2l外顯子(L858R)突變9例,雙突變1例,且其EGFR基因突變類型均與其對(duì)應(yīng)的組織標(biāo)本一致,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,胸水細(xì)胞塊與組織標(biāo)本EGFR基因總突變率差異無顯著性意義(P>0.05)。經(jīng)過分析后發(fā)現(xiàn)與組織標(biāo)本檢測結(jié)果不符的為1例血性胸水,原因可能是血性胸水中含有大量的紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、間皮等細(xì)胞,那么腫瘤細(xì)胞的含量就會(huì)相對(duì)較少,這樣就會(huì)使我們所獲得的DNA提取液中的野生DNA含量過高,腫瘤DNA含量低于總量的1%,超出了檢測試劑盒的最低檢測能力范圍,從而出現(xiàn)DNA提取液的濃度和質(zhì)量均符合檢測標(biāo)準(zhǔn),但檢測結(jié)果卻可能出現(xiàn)陰性的現(xiàn)象。

近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,應(yīng)用小分子基因靶向治療藥物酪氨酸激酶抑制劑治療NSCLC患者,可以有效地改善患者的生活質(zhì)量,并延長了患者的生命[16],EGFR基因突變的檢測是指導(dǎo)應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑治療的必要前提[17]。目前,我國NSCLC患者的EGFR基因突變檢測率不高,難以獲得滿意的檢測標(biāo)本是其主要原因之一。臨床中推薦使用腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行EGFR突變檢測,但是對(duì)于心肺功能較差或已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會(huì)的晚期患者組織標(biāo)本獲取往往比較困難,胸腔積液是晚期NSCLC患者常見的并發(fā)癥,獲取胸水標(biāo)本比較容易,并且創(chuàng)傷較小,容易被患者接受。本研究結(jié)果顯示,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測胸水EGFR基因突變的結(jié)果與組織標(biāo)本檢測結(jié)果具有較高的一致性。然而由于本研究的時(shí)間跨度比較長,胸水細(xì)胞塊的EGFR基因突變檢測是集中后分批進(jìn)行的,其間可能存在胸水標(biāo)本的類型、試劑的批間差異和人為操作等因素的影響,致使此種方法應(yīng)用于臨床還有待于進(jìn)一步研究。后期將繼續(xù)完善不同類型胸水細(xì)胞塊的制作方法,并擴(kuò)大檢測樣本量,獲得更多數(shù)據(jù)資料,以拓寬了解非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變情況的有效途徑,以期為臨床應(yīng)用EGFR酪氨酸激酶受體抑制劑治療NSCLC提供一定的參考價(jià)值。

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Clinical significance of EGFR gene mutation in pleural effusion cell blocks in non-small cell lung cancer

YU Le,ZHU Qigan,YANG Limin,WEN Lusheng,KUI Guoju,PAN Xianxin,MENG Jiarong*
(DepartmentofPathology,175thHospitalofPLA,DongnanAffiliatedHospitalofXiamenUniversity,Zhangzhou363000,China;*Correspondingauthor,E-mail:mengjiarong@sina.com)

ObjectiveTo explore the clinical significance of EGFR mutations in positive pleural effusion cell block of non-small cell lung cancer by RT-PCR.MethodsSixty cases of biopsy tissue specimens and pleural effusion from non-small cell lung cancer patients were collected.Cell blocks of pleural effusion specimens were made.DNA was extracted to detect EGFR mutation in exon 19 (19-Del) and exon 21 (L858R) in biopsy tissue specimens and pleural effusion by RT-PCR.The mutation rate of EGFR was analyzed between pleural effusion and biopsy tissue specimens.ResultsThe mutation rate of EGFR in pleural effusions was 35%(21/60),including 11 cases of 19-Del mutation，9 cases of L858R mutation,and 1 case of 19-Del and L858R double mutations.The mutation rate of EGFR in biopsy tissue specimens was 36.7%(22/60),including 12 cases of 19-Del mutation,9 cases of L858R mutation,and 1 case of 19-Del and L858R double mutations.The rates of EGFR mutation was not significantly different between the two types of specimens(P>0.05).The EGFR mutation types in pleural effusion were the same as that of the tissue specimen.ConclusionPleural effusion cell block and biopsy tissue specimen show high consistency in EGFR mutation.

lung cancer; pleural effusion; cytology; EGFR gene

福建漳州市科技局科研資助項(xiàng)目(z2011066);南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助項(xiàng)目(10MA076);解放軍第175醫(yī)院院內(nèi)青年苗圃基金資助項(xiàng)目(16Y020)

禹樂,男,1984-07生,學(xué)士,主管技師,E-mail:422245066@qq.com

2016-12-24

R734.2

A

1007-6611(2017)05-0462-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.013