SNS314對乳腺癌細胞T47D生長的影響

張 月，王耀一，武雪亮，周海豐，梁晚平(河北北方學院附屬第一醫院乳腺外科,張家口 075000;通訊作者,E-mail:zhangyue906@tom.com)

SNS314對乳腺癌細胞T47D生長的影響

張 月，王耀一，武雪亮，周海豐，梁晚平*
(河北北方學院附屬第一醫院乳腺外科,張家口 075000;*通訊作者,E-mail:zhangyue906@tom.com)

目的 探討SNS314對體外培養人乳腺癌T47D細胞生長的影響。 方法 用0,0.001,0.01,0.1,1,10 μmol/L SNS314分別處理T47D細胞，采用MTT法評價SNS314對人類乳腺癌細胞增殖的影響，流式細胞術檢測細胞周期。Western blot檢測總AuroraA(T-Aurora A)、磷酸化Aurora A(p-Aurora A)、磷酸化組蛋白(p-Histone H3)、總組蛋白(T-Histone H3)和凋亡相關蛋白以及Cyclin B1表達水平的變化。免疫熒光檢測多核細胞形成，Annexin Ⅴ-FITC與PI雙染檢測細胞凋亡率。 結果 不同濃度的SNS314分別處理T47D細胞24 h、48 h，T47D增殖明顯抑制，IC50分別為(2.684±0.429)μmol/L和(0.309±0.510)μmol/L；流式細胞術顯示隨著濃度增加，G2/M期細胞由(21.40±0.53)%升高至(93.73±0.06)%，G2/M期阻滯呈劑量依賴性；Western blot顯示SNS413處理后p-Aurora A、p-Histone H3蛋白表達受到抑制，Cyclin B1的表達下調，Bcl-2表達降低，促進PARP蛋白剪切及增強Bax表達。免疫熒光檢測到多核細胞，Annexin Ⅴ-FITC與PI雙染檢測顯示細胞凋亡率由(2.07±0.21)%增加到(32.47±2.65)%，與SNS314 0 μmol/L組比較，凋亡率顯著增加(P<0.05)。 結論 SNS314抑制乳腺癌細胞T47D的增殖、誘導凋亡，且呈劑量依賴性。

乳腺癌； SNS314； Aurora激酶； 細胞增殖； 細胞凋亡

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，對女性的健康與生命安全構成嚴重的威脅，據我國疾病預防控制中心流行病學調查乳腺癌位居我國女性惡性腫瘤第一位[1]。研究表明Aurora 激酶與乳腺癌的關系比較密切，乳腺癌中Aurora A和Aurora B的表達是比較常見的，表達率為26%-94%，Aurora激酶已經作為分子靶點表現了抗腫瘤能力，Aurora激酶家族為絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞周期調控中起著重要的作用，Aurora激酶的過表達會干擾有絲分裂檢查點的功能，導致遺傳的不穩定性和誘發腫瘤的增長。SNS314作為小分子Aurora激酶抑制劑，可同時抑制Aurora A、B，有研究表明SNS314具有抑制細胞增殖的效應，抑制組蛋白H3的磷酸化、阻止細胞周期進程，使細胞失去生存能力，誘導細胞凋亡的作用，但其對乳腺癌T47D細胞的作用研究不多。本研究的實驗主要檢測SNS314抑制人乳腺癌T47D細胞的增殖效應，誘導凋亡并且初步探討與其相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人乳腺癌細胞株T47D由河北北方學院中心實驗室提供；SNS314購自美國Selleck公司；RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；BCA蛋白分析試劑盒購自美國Pierce公司；DAPI染液購自北京中杉金橋生物技術有限公司； p-Aurora A、p-Histone H3、Aurora A、Histone H3、PARP、Bcl-2、Bax一抗購于美國Cell Signaling Technology公司；二抗購自Santa Cruz 公司；FITC-Annexin Ⅴ凋亡試劑盒購于BD公司(美國)。

1.2 細胞培養及處理

對照組T47D細胞株常規培養于RPMI 1640培養液中，內加10%胎牛血清、人青霉素(濃度100 U/ml)和鏈霉素(濃度100 μg/ml)，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養,處理組分別給予SNS314 0.001,0.01,0.1,1,10 μmol/L處理。

1.3 MTT法檢測細胞生存率

取對數生長期的T47D細胞以1×104個/ml細胞濃度接種于 96 孔板內，每孔 0.1 ml。取不同的濃度SNS314(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)處理T47D細胞24,48 h ,每孔加入20 μl濃度為 5 g/L的 MTT，繼續培養 4 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜 200 μl震蕩 10 min充分溶解顯色，酶標儀波長 570 nm處檢測吸光度 (A值) ，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(對照孔A值-加藥孔A值)/對照孔A值×100%。

1.4 Western blot檢測 Aurora激酶及凋亡相關蛋白的表達

將實驗組(0.001,0.01,0.1,1,10 μmol/L SNS314)和對照組(0 μmol/L)細胞的蛋白樣品30 μg分別行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，37 mA恒流1 h將蛋白電轉移至PVDF膜上，含5%牛奶TBST封閉纖維素膜0.5 h，加入一抗4 ℃過夜，TBST洗滌 3次，然后與二抗(辣根過氧化物酶標記)室溫孵育1 h后TBST洗滌3次， ECL顯影，曝光。檢測Aurora A、Histone H3、p-AuroraA、p-Histone H3、PARP、Bcl-2、Bax?？笰urora A、Histone H3、p-AuroraA、p-Histone H3、PARP、Bcl-2、Bax，抗體稀釋比例為1 ∶1 000，β- actin抗體稀釋比例為1 ∶10 000，二抗稀釋比例1 ∶10 000 。

1.5 流式細胞術分析細胞周期改變

分別用對照組(未處理)、抑制劑組(SNS3140.001,0.01,0.1,1,10μmol/L)處理T47D 24 h后，收集細胞并調整細胞數至1×106個/ml，用冷PBS洗滌細胞，離心1 000 r/min，5 min兩次，預冷的95%乙醇固定，離心乙醇固定的細胞，棄去乙醇，加入PI(50 μg/ml)與RNase(1 μg/ml)混合物500 μl作用 15 min后，在流式細胞儀上機分析，檢測1×104個細胞，并用multicycle軟件進行細胞周期的分析。

1.6 免疫熒光觀察核的改變

對細胞進行消化、計數，調整細胞密度至103/ml，把預先處理的無菌玻片放入12孔板中，將以上細胞懸液滴入每孔(保證每孔為2 ml)，放入37 ℃、5% CO2孵箱中培養過夜使其貼壁。給予SNS314 1 μmol/L處理48 h后，將培養液棄去，用預冷的1×PBS洗3次(5 min/次)，經4%多聚甲醛固定、0.2%Triton-X100破膜、DAPI著色5-10 min，1×PBS洗3次后封片，在熒光顯微鏡下觀察，共聚焦顯微鏡下采圖。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率

分別用對照組(未處理)、加藥組SNS314 0.1,1,10 μmol/L分別處理T47D 24 h后，收集細胞，并調整的細胞數至1×106個/ml，用冷PBS洗滌細胞兩次。加入Binding 緩沖液100 μl、FITC Annexin-Ⅴ 5 μl、PI(50 μg/ml)10 μl，室溫避光孵育15 min后加入Binding 緩沖液400 μl細胞懸液中加入孵育20-30 min。流式細胞儀FACScan測定，經計算機軟件處理計算凋亡細胞百分率。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 SNS314抑制細胞生長

MTT法顯示隨著SNS314濃度和作用時間的增加呈現明顯的量效關系，抑制率曲線呈上升的趨勢,與對照組(0 μmol/L)比較，差異有統計學意義(P﹤0.05)，24,48 h的IC50值分別為(2.684±0.429)μmol/L、(0.309±0.510)μmol/L，10 μmol/L SNS314 作用于T47D細胞24 h抑制率為(65.78±0.01)%,作用48 h后抑制率可達(83.19±0.01)%(見圖1)。

與對照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05圖1 MTT檢測不同濃度不同時間SNS314對T47D細胞抑制率曲線 (n=3)Figure 1 Effect of different concentrations of SNS314 on proliferation of T47D cells (n=3)

2.2 SNS314可以導致G2/M期阻滯流式細胞術顯示SNS314濃度從0 μmol/L到

10 μmol/L,顯示G0/G1期細胞由(49.30±0.66)%降至(5.13±0.21)%，S期細胞由(29.30±0.30)%降至(1.12±0.11)%，G2/M期細胞由(22.40±0.53)%升高至(93.75±0.06)%(見表1)，實驗組與對照組(0 μmol/L)比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

表1 SNS314作用于T47D細胞24 h對細胞周期的影響 (%)

Table 1 Effect of SNS314 for 24 h on cell cycle of T47D cells (%)

SNS314的濃度(μmol/L)G0/G1SG2/M0 49．30±0．6629．30±0．3022．40±0．530．00136．00±0．4628．77±0．3134．23±0．670．01 31．50±0．15?20．40±0．82?48．10±0．16?0．1 16．33±0．54?5．63±0．41?79．04±0．75?1 8．63±0．25?4．26±0．31?87．11±0．35?10 5．13±0．21?1．12±0．11?93．75±0．06?

2.3 SNS314對Aurora A、組蛋白H3磷酸化水平的影響

隨著SNS314濃度的增加，Aurora A和Histone H3總蛋白表達沒有明顯變化，而Aurora A、組蛋白H3磷酸化水平的表達逐漸減弱，CyclinB1的蛋白表達減少,呈現明顯的遞減趨勢(見圖2)。

1.對照組(0 μmol/L);2. 0.001 μmol/L SNS314;3. 0.01 μmol/L SNS314;3. 0.1 μmol/L SNS 314; 4. 1 μmol/L SNS314;5.10 μmol/L SNS314圖2 Western blot檢測SNS314作用于T47D細胞24 h后磷酸化Aurora激酶和磷酸化組蛋白以及凋亡相關蛋白表達的變化Figure 2 The expression of phosphorate Aurora A,phosphorate Histone H3 and apoptosis-related protein after treated with SNS314 for 24 h by Western blot

2.4 SNS314對T47D細胞細胞核的影響

對照組 SNS314 0 μmol/L作用于T47D細胞核沒有改變，當1 μmol/LSNS314作用于T47D細胞可見細胞核形態改變，出現核的分葉現象，多核細胞的產生，最終形成多倍體細胞，影響胞質的正常分裂，細胞最終走向凋亡(見圖3)。

A.對照組 B.1 μmol/L SNS314 圖3 SNS314作用于T47D細胞48 h對T47D細胞核的影響Figure 3 Effect of SNS314 on cell nucleus of T47D cells after treatment for 48 h

2.5 SNS314對凋亡的影響

隨著SNS314濃度的增加，PARP的剪切帶和Bax的表達水平增加，Bcl-2蛋白的表達減少(見圖2)。Annexin Ⅴ-FITC與PI雙染顯示SNS314 0，0.1，1，10 μmol/L作用T47D細胞24 h凋亡率分別為(2.07±0.21)%、(7.83±0.31)%、(10.03±0.31)%、(32.47±2.65)%，隨著藥物濃度的增加，凋亡率增加(見圖4)。

A.對照組 B.SNS314 0.1 μmol/L C.SNS314 1 μmol/L D.SNS314 10 μmol/L圖4 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測SNS314對細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of SNS314 on apoptosis of T47D cells by Annexin Ⅴ-FITC/PI

3 討論

Aurora A、B、C是Aurora激酶家族中的3個成員，主要在調節中心體成熟、有絲分裂紡錘體形成、胞質分裂中占有重要的地位。它們在多種腫瘤如乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌等中過表達[2]，其中在94%浸潤性乳腺癌中過表達Aurora A,而在正常組織中低表達，Aurora A可作為乳腺癌獨立的預后因素[3]，Aurora A主要在G2/M期達到高峰，調節細胞周期中G2/M轉換，是調節M期進展的關鍵因子[4]。Aurora B調節有絲分裂的關鍵步驟：Aurora B使組蛋白H3磷酸化[5]。Aurora B作為染色體信使復合物，保證染色體的分離和線性結構，在細胞周期進展和完成有絲分裂的過程中扮有重要角色。

過去十幾年中，藥物領域主要研究Aurora A與人類腫瘤的關系,如何抑制Aurora A達到抑制腫瘤的效果，對于Aurora B的研究甚少，Aurora B受抑制后核內發生復制，多倍體細胞聚集，最終導致有絲分裂失敗和細胞凋亡，研究表明細胞增殖至關重要的是Aurora B而不是Aurora A。

Arbitrario等[6]研究表明SNS314是ATP競爭性結合性小分子Aurora激酶抑制劑，可抑制細胞的增殖，抑制組蛋白H3的磷酸化，細胞出現多倍體現象，胞質分裂失敗。Vander Porten等[7]發現SNS314在結腸癌細胞中有抑制腫瘤細胞增殖、阻斷微管形成的作用，從而發生細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡。本研究以人乳腺癌T47D細胞為研究對象，檢測SNS314對T47D細胞的增殖抑制以及對細胞凋亡的影響，對其分子機制進行了初步探討。MTT顯示10 μmol/L SNS314作用于T47D細胞24，48 h抑制率分別為(65.78±0.01)%、(83.19±0.01)%，IC50分別為(2.684±0.429)μmol/L、(0.309±0.510)μmol/L。流式細胞術顯示細胞周期在加藥組出現了明顯的G2/M期阻滯，G0/G1期細胞由(49.30±0.66)%降至(5.13±0.21)%，S期細胞由(29.30±0.30)%降至(1.12±0.11)%，G2/M期細胞由(22.40±0.53)%升高至(93.75±0.06)%，實驗組與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。本實驗結果與文獻報道相一致[8]。

Aurora A轉化為磷酸化Aurora A才能發揮活性，Cyclin B1是細胞周期中的一種重要的蛋白，使細胞通過G2/M期的檢查點，促進細胞G2/M期的轉換，它在有絲分裂中后期被降解，促進有絲分裂完成，促使細胞周期的運行[9,10]。Cyclin B1為磷酸化Aurora A的下游基因，因而干擾磷酸化的Aurora A形成會影響到G2/M細胞周期的運行，使細胞發生凋亡， Bcl-2/Bax比例是決定細胞進入凋亡與否的關鍵因素[11]，細胞發生凋亡后可以誘導促凋亡蛋白Bax表達增加，PARP剪切帶表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達減少。本研究中Western blot結果顯示磷酸化Aurora A和磷酸化組蛋白H3的表達隨著濃度的增加逐漸減少。隨著SNS314藥物濃度的增加伴隨Cyclin B1的蛋白表達量減少，這說明細胞的增殖抑制可能與下調Cyclin B1的表達，不能有效調節G2/M期細胞周期的進展，這與文獻[7]報道一致。T47D細胞經過不同濃度SNS314處理后Bcl-2與Bax的表達呈相反趨勢即Bax的蛋白表達量增加，Bcl-2的蛋白表達量減少，細胞進入凋亡。同時，流式細胞術Annexin-Ⅴ/PI雙染顯示隨著SNS314濃度的增加，細胞凋亡率由(2.07±0.21)%增加到(32.47±2.65)%，凋亡細胞明顯增加。SNS314抑制磷酸化Aurora A的同時也抑制磷酸化組蛋白H3的表達，Western blot顯示隨著藥物濃度的增加磷酸化H3的表達減少，免疫熒光顯示1 μmol/L SNS314作用于乳腺癌T47D細胞48 h，DNA聚集，多核形成，多倍體細胞產生，胞質分裂失敗，最終細胞發生凋亡。

總而言之，本實驗SNS314抑制乳腺癌細胞T47D細胞增殖，發生凋亡主要兩種途徑：一方面抑制磷酸化AuroraA從而下調Cyclin B1的表達，另一方面抑制磷酸化組蛋白H3，干擾Aurora B功能，影響細胞的胞質分裂，使細胞發生G2/M期阻滯，形成多倍體細胞，干擾細胞周期的進程，Bcl-2的表達下降，PARP剪切帶與Bax的表達增加，誘導T47D細胞發生凋亡。

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Effects of Aurora kinase inhibitor SNS314 on growth of breast cancer cells

ZHANG Yue,WANG Yaoyi,WU Xueliang,ZHOU Haifeng，LIANG Wanping*
(DepartmentofMammographySurgery,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China;*Correspondingauthor,E-mail：zhangyue906@tom.com)

ObjectiveTo investigate the effects of SNS314,a new Aurora kinase inhibitor,oninvitrogrowth of T47D breast cancer cell lines.MethodsT47D cells were culturedinvitrowith different concentrations of SNS314(0,0.001,0.01,0.1,1,10 μmol/L),respectively,and the cells at logarithmic growth phase were used for this experiment.The effect of SNS314 on cell proliferation was examined by MTT assay.Cell cycle of T47D cells was determined by flow cytometry.The levels of phosphorate-Aurora A(p-Aurora A),total Aurora(T-Aurora),phosphorate-Histone H3,total Histone H3,Cyclin B1 and apoptosis relative protein expression(Bcl-2,Bax,PARP) were detected by Western blot.The variety of nucleus was observed by immunofluorescence.The ratio of apoptotic cells was detected by flow cytometry.ResultsDifferent concentrations of SNS314 significantly inhibited the proliferation of T47D cells after treatment for 24 h or 48 h in a dose-dependent manner,with the IC50of (2.684±0.429) μmol/L and (0.309±0.510) μmol/L.The percentage of G2/M cells was increased from (21.40±0.53)% in 0 μmol/L group to (93.73±0.06)%in 10 μmol/L group.Flow cytometry showed G2/M cells were arrested in a dose-dependent manner.Western blot showed that SNS314 inhibited dose-dependently p-Aurora A,p-Histone H3,Cyclin B1,Bcl-2,while promoted the dissection of PARP and the expression of Bax.SNS314 showed no significant effect on the expression of T-Aurora,T-Histone H3.SNS314 induced multinuclear by immunofluorescence.The ratio of apoptotic cells increased from (2.07±0.21)% in 0 μmol/L group to (32.47±2.65)% in 10 μmol/L group.Compared with 0 μmol/L group,the apoptosis ratio was increased in 10 μmol/L group(P<0.05).ConclusionSNS314 may inhibite the proliferation and induce the apoptosis of T47D cells in a dose-dependent manner.

breast cancer； SNS314； Aurora kinase； cell proliferation； cell apoptosis

河北省醫學科學研究重點課題資助項目(ZD20140243)

張月，女，1984-10生，碩士,主治醫師,E-mail:zhangyueyue906@163.com

2017-02-15

R737.9

A

1007-6611(2017)05-0436-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.007