薄型子宮內膜小鼠模型的建立及初步鑒定

張引紅,王春芳,陳朝陽,張銳虎,李瑞嬌,李紅霞(山西醫科大學實驗動物中心,實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室,太原 03000;山西省生殖科學研究所;通訊作者,E-mail:6445935@qq.com)

薄型子宮內膜小鼠模型的建立及初步鑒定

張引紅1,王春芳1,陳朝陽1,張銳虎1,李瑞嬌2,李紅霞2*
(1山西醫科大學實驗動物中心,實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室,太原 030001;2山西省生殖科學研究所;*通訊作者,E-mail:644529325@qq.com)

目的 探討宮腔注射95%乙醇制作薄型子宮內膜小鼠模型的可行性。 方法 雌性C57BL/6J小鼠30只,性成熟未交配,動情期規律。隨機分為實驗組、對照組、空白對照組,每組10只。實驗組宮腔注射95%乙醇并滯留2 min進行損傷,對照組宮腔注射生理鹽水,注射量和滯留時間與實驗組相同,空白組進行開腹縫合手術但不對宮腔進行任何處理。造模結束后第3個動情期處死小鼠,取子宮樣本進行外觀、子宮內膜厚度和HE染色等觀察分析。 結果 宮腔注射95%乙醇后小鼠子宮迅速脫水,發白,失去彈性。3個動情期后子宮粗細不均,局部有出血點,紅白相間。子宮內膜厚度變薄。HE染色后發現實驗組子宮內膜層明顯變薄,宮腔隙增大;腺體數量減少,內膜上皮及腺上皮細胞扁平化,局部血管稀疏。 結論 宮腔注射95%乙醇形成的薄型子宮模型符合預期,可用于薄型子宮形成機制、修復等研究,是一種較理想的薄型子宮內膜動物模型。

薄型子宮內膜; 95%乙醇; 動物模型; 動情期; HE染色

近年來,女性子宮內膜過薄現象逐年嚴重,已經成為體外受精-胚胎移植中周期取消和種植失敗的重要原因之一[1]。臨床上對于薄型子宮的確診多依賴于超聲和宮腹腔鏡檢查,很少能直接獲得可供研究的人體組織標本[2]。因此,建立穩定的薄型子宮內膜動物模型,深入研究子宮內膜及肌層損傷前后組織結構的變化及相關功能修復機制[3],積極探索有效的干預措施,減少瘢痕形成、幫助子宮重建及提高妊娠成功率[4],是一項重要且緊迫的課題。

目前針對薄型子宮內膜造模方法僅有一種,即將高濃度乙醇宮腔注射損傷法構建薄型子宮大鼠模型[5-7],本實驗參考該方法,利用高濃度乙醇的脫水及蛋白質變性作用,將95%乙醇灌注進入小鼠宮腔,對小鼠子宮內膜進行損傷,構建一種小鼠薄型子宮內膜的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物來源

性成熟未交配雌性C57BL/6J小鼠,SPF級,8周齡,質量20 g左右。由山西醫科大學實驗動物中心[SCXK(晉)2015-0001]提供。飼養條件:山西醫科大學實驗動物中心屏障環境動物實驗室[SYXK(晉)2015-0001],每5只一籠,溫度(25±2)℃,濕度(55±2)%,光照明暗時間比為12 h/12 h,自由獲取食物和水。

1.2 試劑及儀器

戊巴比妥鈉 (Ceres Chemical)、無水乙醇 (國藥集團化學試劑有限公司)、生理鹽水 (山東華魯制藥有限公司)、伊紅 (bioswamp)、蘇木素 (bioswamp)、甲醛 (國藥集團化學試劑有限公司)、中性樹脂 (bioswamp)。

研究級正置顯微鏡 (Olympus IX51)、組織脫水機 (湖北康強醫療器械有限公司)、石蠟包埋機 (湖北泰維科技視野有限公司)、石蠟切片機 (徠卡顯微系統有限)、攤片烤片機 (湖北康強醫療器械有限公司)、IMS圖像分析系統 (武漢華聯科生物技術有限公司)

1.3 方法與步驟

1.3.1 動情期測定及分組 每日上午8:30做陰道脫落細胞涂片檢查。確定小鼠動情周期狀況并連續觀察兩個動情周期。

動情期不規律者剔除。補足動物再次測定。

將動情期規律小鼠按照隨機數字表分為三組,每組各10只。其中實驗組為宮腔注射95%乙醇,隨后進行生理鹽水沖洗。對照組宮腔注射生理鹽水,空白組進行開腹縫合手術,但不進行宮腔注射。

1.3.2 手術 實驗小鼠麻醉,麻醉藥為1.5%戊巴比妥鈉,劑量為80 mg/kg。待成功麻醉,無翻正反射和眼瞼反射后,將小鼠四肢用橡皮筋固定在手術板上。小鼠腹部用75%乙醇進行消毒,尿道口上端1 cm處縱行剪開皮膚,切口約1 cm。逐層分離進入腹腔,膀胱后方可見粉紅色V狀子宮,粗細均勻。用無齒鑷將子宮拉出體外,周圍墊無菌紗布。將子宮近輸卵管端及近子宮頸端分別用血管夾夾住,無齒鑷拉直子宮,從近宮頸口插入1 ml注射器,緩慢注射95%乙醇至子宮充盈,等候2 min,吸走乙醇,用生理鹽水反復沖洗宮腔3次。子宮小心放回原本位置,用生理鹽水沖洗腹腔。取出另一側子宮,重復操作。關腹,逐層縫合[5]。對照組宮腔注射生理鹽水,實驗操作同上。空白組實驗操作同上,但不注射任何試劑。

取樣:術后連續觀察3個動情期,擇第3個動情期當日取子宮,浸泡于4%多聚甲醛中。

1.4 薄型子宮小鼠的鑒定

1.4.1 手術過程觀察 觀察宮腔注射95%乙醇前后子宮狀態的改變,同時與同一小鼠另一側子宮作對比。

1.4.2 術后觀察 術后第3個動情期取樣,對是否有腹腔粘連、宮腔粘連、子宮外觀形態等進行觀察。同時與對照組樣本進行對比。

1.4.3 子宮內膜厚度測量 常規HE染色后,IMS圖像分析系統測量子宮內膜厚度。

1.4.4 組織形態學觀察 常規HE染色后,光鏡下觀察子宮內膜厚度變化,腺體和血管分布情況,各層細胞形態學改變等。

2 結果

2.1 手術過程觀察

術前,小鼠子宮外觀呈粉紅色,內部充盈液體但不腫脹,粗細均勻,彈性有光澤(見圖1A);注射過程中,發現小鼠子宮逐漸變白,組織僵化(見圖1B);注射完畢后,小鼠子宮發白,質地變硬(見圖1C);與同一小鼠另一側未手術子宮對比,手術子宮明顯失去光澤,質地僵化,嚴重脫水,變白(見圖1D)。

2.2 術后觀察

對照組子宮充盈,彈性有光澤(見圖2A);實驗組個別小鼠子宮有輕微腹腔粘連,接觸部分完全脫水,易碎。實驗組子宮外觀顏色發白或發黃,局部有出血點,紅白相間(見圖2B)。子宮體形態不規則,失去彈性,質地變硬,縱切開后無宮腔粘連,局部有黃白狀膿狀物質(見圖2C)。

2.3 子宮內膜厚度測量

空白組子宮內膜平均厚度為(454.5±21.08)μm,對照組子宮內膜平厚度為(462.8±16.17)μm,對照組與空白組對比,無統計學差異;實驗組子宮內膜平均厚度為(174.3±35.27)μm,與空白組和對照組相比,具有統計學差異(P<0.05)。

A.宮腔注射前 B.宮腔注射中 C.宮腔注射后 D.另一側未注射95%乙醇圖1 宮腔注射95%乙醇手術過程Figure 1 Process display of intrauterine injection of 95% ethanol

A.對照組3個動情期后子宮,彈性有光澤;B.實驗組3個動情期后子宮,外觀顏色發白,局部有出血點,紅白相間;C.實驗組3個動情期后子宮形態不規則,縱切開后無宮腔粘連,局部有黃白色膿狀物質圖2 術后子宮形態觀察Figure 2 Morphology of uterus after operation

2.4 組織形態學觀察

小鼠子宮由外至內分為漿膜層、肌層、內膜層。其中內膜層最厚,與對照組相比,實驗組子宮內膜層明顯變薄,宮腔隙增大;腺體數量減少,內膜上皮及腺上皮細胞扁平化,局部血管稀疏(見圖3)。

3 討論

薄型子宮內膜是女性不孕癥的重要病因之一,臨床一般認為黃體中期厚度小于7 mm,即有可能改變子宮內膜容受性,導致胚胎著床率降低[8]。然而臨床上薄型子宮內膜尚未確立統一的診斷標準,原因在于其不僅發病原因復雜,病理、生理特征多樣,發病機制亦不明確[1]。目前針對薄型子宮內膜治療的方式較多,包括宮腔注射雌激素,手術搔刮,盆底肌鍛煉,粒細胞集落因子注射、高壓氧治療等,但治療效果并不顯著,尤其是個體差異非常明顯[9]。因此,建立一個相似度高的實驗動物模型,深入研究薄型子宮內膜的形成機制及治療方式,是非常有必要的。

目前關于子宮內膜損傷的實驗動物模型多集中在宮腔粘連、子宮內膜異位癥、子宮內膜全層去除等方面,單純的薄型子宮內膜模型僅有高紅[5]構建薄型子宮大鼠模型所用高濃度乙醇宮腔注射損傷法,其余相關文獻[6,7]均為本基礎上改進所成,且實驗動物僅局限于大鼠。尤昭玲等[10]將厭氧消化鏈球菌、致病性大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌三種子宮內膜炎癥主要細菌感染恒河猴子宮內膜,成功構建恒河猴子宮內膜炎性出血模型,較好地模擬了臨床常見的炎癥導致的異常出血相關疾病;曹興鳳等[11]利用自制的小刮勺對比格犬子宮內膜進行搔刮,兩個月后取樣觀察發現實驗組子宮內膜變薄,內膜表面纖維化,腺體減少,從實驗方法到結果都良好地模擬了臨床宮腔粘連的形成及癥狀;另外目前還有 Li等[12]利用宮腔放置銅絲和機械搔刮雙重損傷構建新西蘭兔宮腔粘連模型,Da等[13]利用無線電射頻裝置構建比格犬子宮內膜消融模型,曲軍英等[14]參考熱球子宮內膜去除術原理將85 ℃熱水流經小鼠子宮內膜損傷子宮形成宮腔粘連等多種模型。

A1.空白對照組(×40); B1.對照組(×40);C1.實驗組子宮內膜層明顯變薄,腺體數量減少(×40);A2.空白對照組(×200);B2.對照組(×200);C2.實驗組子宮內膜層變薄,肌層基本無變化,宮腔隙增大,內膜上皮細胞扁平化,局部血管減少(×200)圖3 三組小鼠子宮組織HE染色光鏡觀察Figure 3 The HE staining n of mouse uterine tissues after under microscopy in the three groups

本課題參考相關方法及手段,最后決定采用高紅[5]構建薄型子宮大鼠模型所用高濃度乙醇宮腔注射損傷法。無水乙醇作為一種可迅速使細胞脫水及蛋白質變性的試劑,效果顯著,時間和劑量可控,比之細菌感染、無線電損傷等有著明顯的優勢。另外本實驗采用C57BL/6J小鼠進行造模,原因為小鼠雖然沒有月經,但其子宮組織結構與人類相似,均由不同作用的功能層和基底層組成。相應的動情周期亦伴隨著細胞的增生和凋亡。同時小鼠體積較小,易于管理,基因組和信號通路研究較為清楚,各種相關實驗技術和抗體較為成熟,對后續的損傷機制、修復研究均有一定幫助。另外,實驗發現,宮腔注射95%乙醇所構建的小鼠模型子宮內膜層變薄,顏色發白,有明顯的出血點,且HE染色觀察發現腺體稀疏,血管分布情況改變,基本符合臨床薄型子宮相關癥狀。由此可見,本實驗構建的薄型子宮內膜小鼠模型是成功的。

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Establishment and preliminary identification of mouse thin endometrium model

ZHANG Yinhong1,WANG Chunfang1,CHEN Zhaoyang1,ZHANG Ruihu1,LI Ruijiao2,LI Hongxia2 *
(1DepartmentofLaboratoryAnimalScience,ShanxiKeyLaboratoryofLaboratoryAnimalandAnimalModelofHumanDiseases,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2ReproductiveScienceInstituteofShanxiProvince;*Correspondingauthor,E-mail: 644529325@qq.com)

ObjectiveTo explore the feasibility of establishing a stable mouse thin endometrium model by injecting ethanol into the uterine cavity.MethodsThirty female unmated C57BL/6J mice with sexual maturity and regular estrus were chosen for this research.They were randomly divided into experimental group,control group and blank control group.In experimental group,95% ethanol was injected to the uterine cavity for 2 min to damage the uterine cavity.In control group,saline was injected to the uterine cavity,while other factors were the same as experimental group.In blank group,their abdomens were opened and then sewed without liquid injecting to the uterine cavity.The mice were sacrificed in the third estrus period at the end of the model establishing.The appearance of the uterus and the thickness of endometrium were observed,and HE staining were used to observe the morphology.ResultsAfter the injection of 95% ethanol,the uterus of mice became rapidly dehydrated,white,and lose elasticity.After three estruses,the uterus looked uneven,some blood points were found in part of the uterus,and the uterus was white alternating with red in experimental group.In addition,the endometrial thickness became thinner.HE staining showed that the endometrium in experimental group significantly became thinner and the uterine cavity was enlarged,the number of glands was decreased,the epithelial and glandular epithelial cells were flattened,and the partial blood vessels were sparse.ConclusionThe thin uterine model established by the injection of 95% ethanol into the uterine cavity is in accordance with the expectation.It could be used for the study on the mechanism of formation and repair of the thin uterus.

thin endometrium; 95% ethanol; animal model; estrus period; HE staining

山西省重點研發計劃資助項目(201603D321110)；山西省科技基礎條件平臺建設基金資助項目(201605D121019);山西省重點實驗室建設基金資助項目(2015012001-09)

張引紅,女,1972-02生,碩士,實驗師,E-mail:sxndzyh@163.com

2017-04-12

R711

A

1007-6611(2017)05-0432-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.006