成纖維生長因子2在胰腺癌中的表達及對胰腺癌細胞侵襲與轉移的作用和機制

付西峰,董秀山,高 飛,趙海潮(山西醫學科學院,山西大醫院普通外科,太原 030032;通訊作者,E-mail:fxfyisheng@163.com)

成纖維生長因子2在胰腺癌中的表達及對胰腺癌細胞侵襲與轉移的作用和機制

付西峰*,董秀山,高 飛,趙海潮
(山西醫學科學院,山西大醫院普通外科,太原 030032;*通訊作者,E-mail:fxfyisheng@163.com)

目的 探討成纖維生長因子2(FGF2)在胰腺癌中的表達及對胰腺癌PANC-1細胞侵襲轉移的作用和機制。 方法 收集62例患者的胰腺導管細胞癌(PDAC)組織和癌旁正常胰腺(NP)組織,免疫組化法檢測癌組織和癌旁正常胰腺組織中FGF2的表達。將RPMI 1640培養的人胰腺癌細胞PANC-1分為4組:對照組、FGF2組、FGFR2+AZD4547組和FGFR2+LY294002組。Western blot及RT-PCR分別檢測palladin和Akt的蛋白及mRNA表達。Transwell小室細胞侵襲活性實驗和細胞劃痕實驗檢測各組PANC-1細胞侵襲和遷移的能力。 結果 免疫組化顯示,胰腺癌組織中FGF2表達率81%(50/62)高于癌旁正常組織的10%(2/20,P<0.05),且胰腺癌中FGF2表達與腫瘤的分化程度、臨床TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關(P<0.05),與患者性別、年齡和腫瘤部位無關(P>0.05)。Western blot測定顯示:FGF2組palladin和p-Akt的蛋白表達高于其他組(P<0.05)。RT-PCR結果顯示:FGF2組palladin和p-Akt的mRNA表達高于其他組(P<0.05)。Transwell小室侵襲活性實驗結果表明:FGF2組侵襲細胞數高于其他組(P<0.05),FGFR2+AZD4547組和FGFR2+LY294002組侵襲細胞數低于對照組和FGF2組(P<0.05)。細胞劃痕實驗結果表明:FGF2組細胞遷移率高于其他組(P<0.05),FGFR2+AZD4547組和FGFR2+LY294002組細胞遷移率低于對照組和FGF2組(P<0.05)。 結論 FGF2在胰腺癌組織中高表達,與胰腺癌的侵襲和轉移相關,其機制可能是FGF2與其受體FGFR2結合后活化PI3K/Akt信號通路,激活并提高palladin的表達,促進細胞的運動,進而促進腫瘤細胞的侵襲與遷移活動。

成纖維生長因子2； 胰腺癌； 侵襲； 轉移

胰腺癌是具有高度侵襲性的惡性腫瘤,由于其早期浸潤、快速轉移的特征,患者往往預后不良,臨床治愈率低,總體生存率不到6%[1],探討胰腺癌的發生發展過程,了解其侵襲轉移的機制具有重要意義。成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor 2,FGF2)在惡性腫瘤發生發展中的作用已受到廣泛關注。FGF2與其受體(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)結合后可激活腫瘤細胞內相關信號通路,促進細胞的增殖、遷移和侵襲等過程[2],而FGF2在胰腺癌中的表達及其作用的下游底物尚不清楚。我們前期研究發現,細胞支架蛋白palladin高度表達于胰腺癌組織中,且與胰腺癌組織的分化及侵襲轉移等有關[3]。腫瘤細胞內的重要信號通路磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/serine-threonine kinases,PI3K/Akt)可激活palladin,維持其穩定性并促進其表達[4]。作為促細胞生長因子的FGF2,FGF2能否通過PI3K/Akt信號通路激活并誘導palladin表達進而促進胰腺癌細胞的侵襲和轉移,有待于深入研究。本研究擬觀察FGF2在胰腺癌組織中的表達情況,并觀察給予FGF2對體外培養的PANC-1細胞侵襲、遷移以及palladin表達的影響,探討FGF2在促進胰腺癌發生發展中的作用機制,為臨床上胰腺癌的治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床標本

收集2008-10～2015-06在山西醫科大學第一醫院普通外科和山西大醫院普通外科進行胰腺癌手術切除并經病理診斷為胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)的標本62例,包括相應的20例距腫瘤邊緣2 cm以上的正常胰腺(normal pancreas,NP)組織標本。62例PDAC標本中,男性38例,女性24例,年齡(53±10)歲,其中胰頭癌39例,胰體/尾癌23例,患者術前未行任何抗腫瘤治療。按照國際抗癌聯合會(UICC)分類標準分為:低分化24例,中分化20例,高分化18例;有淋巴結轉移34例,無淋巴結轉移28例。按照TNM分期分為:Ⅰ-Ⅱ期25例,Ⅲ-Ⅳ期37例。所有上述標本經中性甲醛固定,石蠟包埋。本研究已經過醫院倫理委員會的審核批準,并獲得患者及其家屬的知情同意。

1.2 細胞株及主要試劑

人胰腺癌PANC-1細胞,購自中科院上海細胞生物醫學研究所;重組人FGF2購自英國Peprotech公司;兔抗人FGF2多克隆抗體、兔抗人p-Akt(ser-473)單克隆抗體和兔抗人palladin多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;山羊抗兔IgG、免疫組化SP試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司;Transwell小室(24孔,0.8 μm)購自美國Corning公司;FGFR2抑制劑(AZD4547)、PI3K/Akt特異性抑制劑(LY294002)購自美國Sigma公司,總RNA提取試劑盒購自上海生工生物科技有限公司。

1.3 免疫組化檢測FGF2表達及結果判定

上述標本經甲醛固定、石蠟包埋、4 μm連續切片,分別行HE染色和免疫組化染色,參照試劑盒說明書進行,PBS液代替一抗作為陰性對照。染色結果由2位病理科醫師采用雙盲法判定,以細胞胞質中出現棕黃色顆粒為FGF2陽性表達。參照課題組前期實驗方法[3],每個光學高倍顯微鏡下隨機選取5個視野,每個視野內計數100個細胞,根據染色面積和染色強度進行評分:①染色面積:0分,0-10%;1分,11%-25%;2分,26%-50%;3分,大于50%。②染色強度:0分,陰性;1分,偏弱;2分,偏中;3分,偏強。染色面積和染色強度的評分相加即FGF2染色的分級:≤3分為FGF2低表達;>3分為FGF2高表達。

1.4 細胞培養及分組處理

將胰腺癌細胞PANC-1接種于RPMI 1640(每毫升含100 U青霉素和100 U鏈霉素)培養液中,37 ℃、5% CO2的培養箱中培養,隔1 d換液1次。細胞長到培養瓶底80%,用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸消化并傳代。取對數生長期細胞進行實驗。細胞培養24 h,隨后即分為4組:對照組(C組,細胞繼續在培養液中生長)、FGF2組(于培養液中加入FGF2 75 ng/ml)、AZD4547組(FGFR2+AZD4547組,在加入FGF2 75 ng/ml的基礎上加入3.0 nmol/L的AZD4547)、LY294002組(FGFR2+LY294002組,在加入FGF2 75 ng/ml的基礎上加入10 μmol/L的LY294002)。四組分別進行Western blot測定、RT-PCR檢測和Transwell小室細胞侵襲活性實驗和細胞劃痕實驗。

1.5 Western blot測定p-Akt和palladin蛋白表達

提取PANC-1細胞總蛋白,BCA定量蛋白質,各樣本蛋白分別取50 μg進行SDS-PAGE電泳分離蛋白,采用電泳轉移法將蛋白轉移至硝酸纖維膜。封閉2 h分別加入一抗兔抗人p-Akt(ser-473)單克隆抗體和兔抗人palladin多克隆抗體孵育過夜,次日洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗孵育。漂洗后進行化學增強發光反應,洗片后掃描電泳條帶。用Image J軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析,以目的條帶與內參β-actin灰度值的比值代表該蛋白的表達水平。

1.6 RT-PCR檢測Akt mRNA和palladin mRNA的表達

按照總RNA提取試劑盒說明書操作，用Trizol試劑盒提取mRNA，將RNA逆轉錄合成cDNA后進行palladin和Akt的基因擴增。以β-actin作為內參照。palladin上游引物5′-GCATCAGAG CTGACCTCAAC-3′，下游引物5′-GGTTGATCACCGAGGCTA AT-3′，片段長度332 bp；Akt上游引物5′-GCGACAGTGGCTATTGTGA-3′，下游引物5′-AGCTGCTCAAAGATGC CATT-3′，片段長度232 bp；β-actin上游引物：5′-GTCAGTGCATCACTACT GGCAAT-3′，下游引物：5′-CGATCTGGTAG GGCCTTG-3′，擴增長度312 bp。PCR反應體系50 μl，反應條件為：95 ℃預變性10 min，活化Tag酶；94 ℃變性15 s，55 ℃退火及延伸60 s，45個循環結束。采用2-ΔΔct計算palladin mRNA和Akt mRNA的相對表達水平。

1.7 腫瘤細胞侵襲和遷移實驗

將PANC-1細胞接種于24孔板,調整細胞濃度為2×105個/ml,每組設6個復孔。采用Transwell小室檢測PANC-1細胞的侵襲能力,將50 μl的Matrigel溶液鋪于上下室之間的聚碳酸酯微孔膜上,再分別加入100 μl和600 μl的RPMI 1640培養基。各組PANC-1細胞經洗滌、消化后按照104/孔接種于小室上層,24 h觀察膜及孔下的細胞數,甲醛固定,PBS漂洗,0.5%結晶紫染液室溫作用10 min。顯微鏡下拍照計數穿過濾膜的細胞數,每孔隨機選取5個視野,取其平均值。通過細胞劃痕實驗測定PANC-1細胞的遷移能力。細胞接種于6孔板,調整細胞濃度為1×106個/ml,細胞貼壁生長90%時進行實驗。用微量移液器的槍頭在培養基中劃一橫隔。PBS后洗去劃下的細胞,加入無血清培養基。0 h和24 h取樣,倒置顯微鏡下拍照。每個樣品取5個視野測量距離。細胞遷移率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 FGF2在PDAC及NC組織中的表達

免疫組化結果顯示,在癌旁正常胰腺組織中FGF2有微量表達,染色較淺(見圖1A、C)。在胰腺癌組織中FGF2高表達,在胰腺癌導管細胞和間質細胞中均有表達,主要定位于細胞質,表現為深棕色顆粒(見圖1B、D)。依據評判標準,FGF2在20例NP組織中高表達2例,低表達18例,FGF2蛋白高表達率為10%;FGF2在62例PDAC組織中高表達50例,低表達12例,FGF2蛋白高表達率為81%。PDAC組織中FGF2蛋白高表達率顯著高于NP組織(χ2=32.529,P<0.000 1)。

A，C分別為正常胰腺(NP)組織HE×100、HE×400；B，D分別為胰腺導管細胞癌(PDAC)組織HE×100、HE×400圖1 不同胰腺組織FGF2蛋白的表達Figure1 TheexpressionofFGF2indifferentpancreatictissues

2.2 PDAC組織中FGF2表達與臨床病理因素的關系

將FGF2免疫組化染色結果與患者的性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、TNM分期、有無淋巴結和遠處轉移進行χ2檢驗,結果見表1。FGF2表達與患者的性別、年齡和腫瘤部位無關(P>0.05),與腫瘤的分化程度、臨床TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關(P<0.05)。

表1 胰腺癌組織中FGF2蛋白表達水平與臨床病理因素之間的關系 例(%)

Table 1 Relationship between the expression of FGF2 in pancreatic adenocarcinoma tissues and clinical pathological factors cases(%)

臨床病理因素nFGF2低表達高表達χ2P性別0 1810 468 男38830 女24420年齡0 2230 462 ≤55歲19316 >55歲43934腫瘤部位2 6620 094 胰頭391029 胰體/尾23221分化程度21．300<0．0001 高分化18108 中分化20119 低分化24123TNM分期7 4360 008 Ⅰ/Ⅱ25916 Ⅲ/Ⅳ37334淋巴結轉移7 2760 008 +32230 -301020遠處轉移5 2000 019 +13013 -491237

2.3 Western blot及RT-PCR結果分析

Western blot測定結果顯示,對照組、AZD4547組和LY294002組,palladin蛋白和p-Akt蛋白僅有微量表達,而FGF2組palladin蛋白和p-Akt蛋白表達明顯高于其他組,RT-PCR也得到了同樣的變化趨勢。對照組、FGF2組、AZD4547組、LY294002組的palladin蛋白表達水平分別為0.19±0.05,0.97±0.04,0.16±0.04,0.16±0.05(F=741.878,P<0.000 1);p-Akt蛋白表達水平分別為0.25±0.06,1.22±0.07,0.20±0.03,0.20±0.05(F=862.371,P<0.000 1);對照組、FGF2組、AZD4547組、LY294002組的palladin mRNA表達水平分別為0.51±0.08,1.19±0.10,0.54±0.08,0.52±0.07(F=161.040,P<0.000 1),Akt mRNA表達水平分別為0.38±0.08,1.36±0.07,0.32±0.04,0.34±0.06(F=587.684,P<0.000 1),四組差異有統計學意義(見圖2及表2)。

圖2 Western blot檢測各組細胞中p-Akt及palladin蛋白的表達Figure 2 The expression of p-Akt and palladin in different groups by Western blot

2.4 腫瘤細胞侵襲和遷移實驗結果

Transwell小室侵襲活性實驗和細胞劃痕實驗結果表明,PANC-1細胞使用FGF2處理后,侵襲細胞數和細胞遷移率增加,而分別給予FGFR2抑制劑AZD4547和PI3K/Akt抑制劑LY294002后,細胞遷移數量和細胞遷移率受到明顯的抑制。FGF2組侵襲細胞數和細胞遷移率明顯高于其他三組(P<0.05),而AZD4547組和LY294002組侵襲細胞數和細胞遷移率較對照組和FGF2組降低(P<0.05,見圖3、4和表2)。

組別侵襲細胞數(個)細胞遷移率(%)Palladin表達Akt表達蛋白mRNA蛋白mRNA對照組71±933±40 19±0 050 51±0 080 25±0 060 38±0 08FGF2組101±9a74±6a0 97±0 04a1 19±0 10a1 22±0 07a1 36±0 07aAZD4547組41±6ab10±2ab0 16±0 04b0 54±0 08b0 20±0 03b0 32±0 04bLY294002組35±5ab13±3ab0 16±0 05b0 52±0 07b0 20±0 05b0 34±0 06b

與對照組比較,aP<0.05;與FGF2組比較,bP<0.05

A．對照組B．FGF2組C．AZD4547組D．LY294002組圖3 各組細胞的Transwell小室侵襲活性實驗(0．5%結晶紫染色，×200)Figure3 TheinvasioncellnumberinfourgroupsbyTranswellchamberassay(×200)

圖4 各組PANC-1細胞的細胞劃痕圖 (×200)Figure 4 The migration rate of PANC-1 cells in different groupby wound healing assay (×200)

3 討論

早期侵襲和迅速轉移是胰腺癌最重要的生物學特性之一,如何在胰腺癌的侵襲和轉移機制中找到突破口,尚沒有明確的答案。近年來,促細胞生長因子和腫瘤發生的關系成為研究的熱點,促細胞生長因子與其特異性受體相結合后,激活細胞內一系列信號通路,在調節細胞增殖、凋亡和血管生成等過程中發揮重要作用[5]。作為促生長因子之一的FGF2,在乳腺癌、胃癌、甲狀腺癌等組織中已被發現有較高水平的表達量,且異常的FGF2/FGF2R信號通路可能促進了腫瘤的發生發展[6,7],而對于FGF2在胰腺癌組織中的表達及在胰腺癌發生發展中的作用未見到相關報道。本研究應用免疫組化染色法檢測了FGF2在胰腺癌組織中的表達,結果表明,FGF2高表達于PDA對照組織中,而在癌旁正常組織中僅有微量表達,且FGF2表達與腫瘤組織的分化程度、臨床分期、淋巴轉移和遠處轉移相關,由此推測FGF2可能參與了胰腺癌的發病過程。FGF2又是通過具體什么機制作用于胰腺癌細胞并對其發揮作用呢?

研究發現,多種腫瘤細胞中存在FGF/FGFR家族介導的信號通路的異常激活,而這些信號通路又可以激活下游蛋白,進一步促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[8,9]。PI3K/Akt是細胞內一條經典的抗細胞凋亡并促進其存活的信號通路,該信號轉導通路若發生異常,可引起細胞異常增殖從而發生腫瘤,PI3K/Akt已被證實參與了大多數腫瘤的發生發展[10,11]。而FGF2與具有酪氨酸激酶活性的FGFR2受體結合后,可引起FGFR2自身磷酸化,然后通過調節亞基與PI3K結合使PI3K活化,進一步引起Akt的磷酸化,而磷酸化后的p-Akt具有龐大的下游信號網絡[12]。本研究繼續通過在細胞水平上檢測了FGF2對胰腺癌PANC-1細胞的作用,結果表明,FGF2單獨作用于PANC-1時,可明顯促進細胞的遷移和侵襲,分別給予FGF2的受體(FGFR2)抑制劑AZD4547及PI3K/Akt信號通路的特異性抑制劑LY294002后,細胞的侵襲和遷移活動較對照組和FGF2組有了明顯的抑制。由此提示,FGF2可能通過PI3K/Akt信號通路而促進PANC-1細胞的侵襲和轉移,參與了胰腺癌的發生發展過程。

蛋白palladin存在于多種組織細胞中,參與細胞的組裝與重構,在調控腫瘤細胞的運動和侵襲遷移中起到關鍵作用。在前期研究中我們發現palladin在胰腺癌組織中高表達,與腫瘤細胞的侵襲和遷移活動相關[3],而調控palladin表達的上游分子信號機制未明確。研究表明,PI3K/Akt可通過加強肌動蛋白細絲重構而促進細胞的運動,若給予PI3K/Akt抑制劑降低Akt的磷酸化水平,細胞的運動能力下降[13]。而細胞運動能力的增強是腫瘤侵襲與轉移的前提,palladin作為一種肌動蛋白相關蛋白,PI3K/Akt可激活palladin并促進其表達,進而增加細胞的運動能力,促進癌細胞的侵襲與遷移[4]。本研究結果表明,Akt和palladin的表達在單獨給予FGF2時較對照組有明顯升高,但在分別給予FGFR2抑制劑及PI3K/Akt信號通路抑制劑后,Akt和palladin的表達與對照組相比沒有明顯變化,但卻比FGF2組明顯降低。由此推測,FGF2可能通過PI3K/Akt信號途徑引起Akt磷酸化加強,進一步激活palladin并提高其表達,進而促進腫瘤細胞的運動能力,引起其侵襲和遷移活動增強。

綜上所述,FGF2在胰腺癌組織中高表達,且與腫瘤組織的分化、臨床分期、淋巴轉移和遠處轉移密切相關。而FGF2促進胰腺癌發生的機制,可能是FGF2通過與其受體FGFR2結合后活化PI3K/Akt信號通路,作用于palladin蛋白,促進細胞的運動,進而促進的腫瘤細胞的侵襲與遷移活動。FGF2有望成為臨床上胰腺癌治療的新靶點。

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Expression of fibroblast growth factor 2 in pancreatic ductal adenocarcinoma tissues and its effects on invasion and metastasis of PANC-1

FU Xifeng*,DONG Xiushan,GAO Fei,ZHAO Haichao
(DepartmentofGeneralSurgery,ShanxiAcademyofMedicalSciences,ShanxiDayiHospital,Taiyuan030032,China;*Correspondingauthor,E-mail:fxfyisheng@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of fibroblast growth factor 2(FGF2) in pancreatic ductal adenocarcinoma(PDAC) tissues and its role in the invasion and metastasis of PANC-1.MethodsImmunohistochemistry assay was performed to detect the expression of FGF2 in 62 cases of PDAC tissues and corresponding adjacent normal pancreas(NP) tissues. The human pancreatic cancer PANC-1 cells were cultured in RPMI 1640 culture medium.The cells were randomly divided into 4 groups:control group,FGF2 group,FGF2+AZD4547 group and FGF2+LY294002 group. Western blot analysis and RT-PCR were performed respectively to detect the expression of palladin and Akt in PANC-1 cells. Transwell chamber assay and wound healing assay were applied to determine the invasive activity and the migration of PANC-1 cells respectively.ResultsImmunohistochemical staining showed that FGF2 was highly expressed in PDAC tissues. The rate of FGF2 expression was 81%(50/62) in PDAC tissues,significantly higher than that of NP tissues (10.0%,2/20) (P<0.05). And FGF2 expression was correlated with the degree of tumor differentiation,clinical TNM classification,lymph node metastasis and distant metastasis in pancreatic tissues(P<0.05),but not related with patient’s sex,age and tumor location(P>0.05). Western blot analysis revealed that the relative expression of FGF2 and p-Akt in FGF2 group was higher than that in the other groups(P<0.05). RT-PCR results showed that the relative expression of FGF2 mRNA and Akt mRNA in FGF2 group was higher than that in the other groups(P<0.05). Transwell chamber assay showed that the invasion cells numbers in FGF2 group were higher than that in other groups(P<0.05). The invasion cells numbers in AZD4547 group and LY294002 group were lower than that in control group and FGF2 group(P<0.05). The wound healing assay showed that the migration rate in FGF2 group was higher than that in the other groups(P<0.05).The migration rates in AZD4547 group and LY294002 group were lower than that in control group and FGF2 group(P<0.05).ConclusionFGF2 is highly expressed in PDAC tissues,and is related to invasion and metastasis of PDAC. FGF2 could enhance the invasion and migration of pancreatic tumor cells by binding to its receptor FGFR2 for activating PI3K/Akt signaling pathway and activating and highly expressing palladin.

fibroblast growth factor 2； pancreatic ductal adenocarcinoma； invasion； metastasis

山西省自然科學基金資助項目(2015011131)

付西峰,男,1974-07生,碩士,副主任醫師,E-mail:fxfyisheng@163.com

2017-02-15

R735.9

A

1007-6611(2017)05-0426-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.005