高糖誘導H9C2大鼠心肌細胞線粒體功能障礙及其機制

左 軍,吳 霞,湯之銘(陜西省第四人民醫院內科,西安 7004;陜西省西北婦女兒童醫院內科;西安市灞橋區人民醫院內科;通訊作者,E-mail:070907@qq.com)

高糖誘導H9C2大鼠心肌細胞線粒體功能障礙及其機制

左 軍1,吳 霞2*,湯之銘3
(1陜西省第四人民醫院內科,西安 710043;2陜西省西北婦女兒童醫院內科;3西安市灞橋區人民醫院內科;*通訊作者,E-mail:1070907222@qq.com)

目的 觀察高糖對H9C2大鼠心肌細胞線粒體功能的影響,以探討高糖所致心肌病發生發展的分子機制。 方法 將H9C2大鼠心肌細胞分為低濃度組(含5 mmol/L葡萄糖),中濃度組(含15 mmol/L葡萄糖)和高濃度組(含30 mmol/L葡萄糖),實驗干預12 h。CCK-8檢測心肌細胞活力。JC-1檢測心肌細胞線粒體膜電位。線粒體ROS熒光探針檢測線粒體ROS水平。Western blot 檢測心肌細胞Bcl-2、Bax、胞質內細胞色素C(Cyt C)及cleaved caspase-3表達水平。 結果 與低濃度組相比,中濃度組心肌細胞活力降低14.5%(P<0.05),高濃度組心肌細胞活力降低26.3%(P<0.01)。低濃度組心肌細胞維持較高線粒體膜電位水平,中濃度組及高濃度組心肌細胞線粒體膜電位明顯降低。與低濃度組相比,中濃度組心肌細胞線粒體內ROS水平明顯降低(P<0.05),高濃度組心肌細胞線粒體內ROS水平顯著降低(P<0.01)。與低濃度組相比,中濃度組心肌細胞Bax/Bcl-2、胞質內Cyt C及cleaved caspase-3表達明顯升高(P<0.05),高濃度組心肌細胞Bax/Bcl-2、胞質內細胞色素 C及cleaved caspase-3表達顯著升高(P<0.01)。 結論 高糖導致心肌細胞線粒體功能障礙,促進了心肌細胞活力降低,可能是高糖所致心肌病分子機制之一。

高糖血癥； H9C2； 心肌病； 線粒體功能障礙

高糖血癥是獨立于高脂血癥、高同型半胱氨酸血癥及高血壓之外,直接影響心臟結構及功能的重要危險因素[1]。臨床及基礎研究均已證實,高糖能夠直接引起心肌細胞功能障礙,導致心臟舒張期延長以及收縮力下降[2,3]。然而,高糖誘導心肌細胞損傷及功能障礙的分子機制尚不明確。線粒體是維持細胞存活的重要細胞器,各種原因導致的線粒體功能障礙是調節細胞凋亡的重要分子通路[4]。此外,線粒體是ROS產生的重要場所,線粒體功能障礙可導致細胞內ROS水平升高,加重氧化應激反應,損傷細胞結構及功能[5]。高糖是否誘導心肌細胞線粒體功能障礙,目前尚不明確。因此,本研究通過體外給予H9C2大鼠心肌細胞高糖刺激,觀察其對心肌細胞線粒體功能的影響,以探討糖尿病心肌病發生發展的分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株與主要試劑

H9C2細胞系由中國科學院細胞庫提供。DMEM培養基購自Gibco公司,胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司,CCK-8細胞活力檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司,JC-1試劑盒及線粒體內ROS熒光探針購自碧云天生物有限公司,兔抗大鼠Bcl-2、Bax、細胞色素C、cleaved caspase-3及 actin抗體購自Abcam公司,辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 H9C2細胞培養及分組

H9C2心肌細胞接種于100 mm培養皿中,加入6 ml含10% FBS低糖DMEM培養基,于37℃,5% CO2培養箱中培養。細胞生長鋪滿皿底80%時,0.25%胰酶消化傳代,接種于6孔板或96孔板,取對數生長期細胞進行實驗。實驗分為低濃度組(含5 mmol/L葡萄糖),中濃度組(含15 mmol/L葡萄糖)和高濃度組(含30 mmol/L葡萄糖),實驗干預12 h。每組設4個復孔。實驗重復3次。

1.3 H9C2心肌細胞活力檢測

將細胞接種于96孔培養板,實驗結束后,棄培養基,PBS洗3次,每孔加入100 μl不含血清的DMEM培養基,每孔再加入10 μl CCK8試劑,混勻后避光置于37 ℃,5% CO2培養箱中孵育45 min,Bio-Rad酶標儀470 nm處檢測吸收光值。

1.4 H9C2心肌細胞線粒體膜電位檢測

將細胞接種于10 mm培養皿中,實驗結束后,棄培養基,冰1×JC-1緩沖液沖洗細胞3次,按說明配制JC-1工作液,每皿加入1 ml JC-1工作液,再加入1 ml DMEM培養基,避光于37 ℃,5% CO2培養箱中孵育25 min,使用預冷的1×JC-1緩沖液沖洗細胞3次。熒光顯微鏡下于紅光及綠光通道處分別觀察同一視野細胞紅光及綠光熒光強度。紅光強度與綠光強度的比為細胞線粒體膜電位的變化。

1.5 H9C2心肌細胞線粒體內ROS檢測

將細胞接種于6孔板,實驗結束后,棄培養基,使用Hank’s液沖液一遍,按1 ∶1 000將ROS探針加入至Hank’s中,混勻后加入6孔板中,每孔1 ml,避光于37 ℃,5% CO2培養箱中孵育15 min,熒光顯微鏡下于紅光通道處觀察熒光強度。

1.6 H9C2心肌細胞相關蛋白Western blot檢測

取高糖干預后細胞，冰PBS沖洗3次，收集細胞，強裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)冰上裂解細胞40 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA蛋白定量后加入5×lodding buffer，100 ℃煮5 min。配制12%的SDS-PAGE分離膠，每泳道蛋白上樣量為30 μg，電泳分離蛋白，將PAGE膠中蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉60 min，放入稀釋(1 ∶1 000)后的一抗中，4 ℃孵育過夜。TBST沖洗后將膜放入堿性磷酸酶標記的二抗中，室溫孵育120 min，TBST沖洗后ECL顯影，Image lab軟件分析各條帶吸光值，分析各組蛋白的相對表達水平。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 高糖對H9C2心肌細胞活力的影響

CCK-8檢測心肌細胞活力結果顯示,低濃度組心肌細胞為98.7%,中濃度組心肌細胞活力約為84.2%,較低濃度組降低14.5%(P<0.05)。高濃度組心肌細胞活力約為72.4%,較低濃度組降低26.3%(P<0.01,見圖1)。

與低濃度組比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 各組H9C2心肌細胞活力Figure 1 The cardiomyocytes viability in different groups

2.2 高糖對H9C2心肌細胞線粒體膜電位的影響

JC-1檢測心肌細胞線粒體膜電位,紅色熒光越強,表明細胞線粒體膜電位水平越高;綠色熒光增強,表明細胞線粒體膜電位水平越低。結果顯示,低濃度組心肌細胞紅色熒光較強,綠色熒光較弱。中濃度組心肌細胞紅色熒光明顯降低,綠色熒光明顯增強。高濃度組含心肌細胞紅色熒光顯著降低,綠色熒光顯著增強(見圖2)。

紅色熒光檢測JC-1 聚合物,為較高線粒體膜電位水平；綠色熒光檢測JC-1單體,為較低線粒體膜電位水平；融合體為紅色與綠色熒光共定位圖2 各組H9C2心肌細胞線粒體膜電位改變 (×40)Figure 2 The change of mitochondrial membrane potential of H9C2 cardiomyocytes in different groups (×40)

2.3 高糖對H9C2心肌細胞線粒體內ROS水平的影響

線粒體ROS熒光探針檢測線粒體ROS水平,紅色熒光強弱可顯示線粒體ROS水平。結果顯示,低濃度組紅色熒光強度較弱;與低濃度組相比,中濃度組紅色熒光明顯增強(P<0.05);與低濃度組相比,高濃度組紅色熒光顯著增強(P<0.01,見圖3)。

圖3 各組H9C2心肌細胞線粒體內ROS水平變化(×40)Figure 3 The mitochondrial ROS level of H9C2 cardiomyocytes in different groups (×40)

2.4 高糖對H9C2心肌細胞線粒體凋亡途徑相關蛋白表達的影響

Western blot 檢測心肌細胞線粒體凋亡途徑相關蛋白表達水平。結果顯示,與低濃度組相比,中濃度組Bcl-2蛋白水平明顯降低,Bax蛋白水平明顯升高,Bax/Bcl-2水平明顯升高(P<0.05);與低濃度組相比,高濃度組Bcl-2蛋白水平顯著降低,Bax蛋白水平顯著升高,Bax/Bcl-2水平顯著升高(P<0.01)。與低濃度組相比,中濃度組胞質內細胞色素 C水平明顯升高(P<0.05),cleaved caspas-3表達明顯升高(P<0.05);與低濃度組相比,高濃度組組胞質內細胞色素 C水平顯著升高(P<0.01),cleaved caspas-3表達顯著升高(P<0.01,見圖4)。

與低濃度組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 各組H9C2心肌細胞Bcl-2、Bax、細胞色素C和cleaved caspase-3表達水平的變化Figure 4 The expression of Bcl-2,Bax,Cyt C,and cleaved caspase-3 in H9C2 cardiomyocytes in different groups

3 討論

目前,隨著生活水平的提高，糖尿病的發病率逐年增高,繼發于糖尿病的心血管并發癥—糖尿病心肌病已成為糖尿病患者死亡的主要原因之一。Framingham研究表明糖尿病患者心衰的發生率明顯升高,其中男性患者增加2-3倍,女性患者較正常人增加5.1倍[6]。糖尿病心肌病的發病機制復雜,目前尚不明確。以往研究表明,高糖可誘導細胞內ROS水平升高,引起細胞內氧化應激反應,加重高糖對細胞損傷[7]。細胞內ROS主要來源于線粒體,且ROS是多種細胞內信號通路激活的啟動因素,比如內質網應激、炎癥因子激活及自噬等[8,9]。我們的研究表明,隨葡萄糖干預濃度升高,線粒體內ROS水平明顯升高,細胞活力明顯下降,提示ROS水平的升高可能與細胞活力下降有關,該結果可能有助于揭示高糖誘導心肌細胞損傷的原因。

線粒體是心肌細胞維持存活的重要細胞器。線粒體功能的失衡可直接導致細胞凋亡事件的發生。以往研究表明,細胞內ROS水平升高是造成線粒體功能下降的主要原因,可導致線粒體膜通透性改變,細胞色素C由線粒體釋放至胞質,激活凋亡執行蛋白caspase-3,啟動caspase依賴的級聯凋亡反應[10,11]。本研究表明,隨葡萄糖干預濃度的升高,線粒體內ROS水平升高,線粒體膜電位水平下降。線粒體維持較高的膜電位對細胞存活起至關重要的作用,高糖可導致心肌細胞線粒體膜電位水平明顯降低,是細胞早期凋亡發生的標志性事件。其次,高糖干預導致心肌細胞Bcl-2表達明顯降低,Bax表達明顯升高,胞質內細胞色素C水平明顯升高。Bcl-2主要定位于線粒體外膜,調控線粒體通透性的改變,Bcl-2表達的降低可導致線粒體膜通透性升高,這是細胞色素C釋放至胞質的主要原因。以往研究報道,細胞色素C由線粒體釋放至胞質可激活caspase-3,caspase-3的激活直接啟動了細胞凋亡程序[12]。本研究顯示,隨胞質細胞色素C水平升高,cleaved caspase-3表達水平明顯升高,提示高糖所致心肌細胞caspase-3的激活可能直接導致了細胞死亡事件的發生。

綜上所述,高糖誘導H9C2心肌細胞線粒體內ROS水平升高,造成線粒體功能受損,細胞色素C釋放至胞質,最終激活casapase依賴的級聯凋亡途徑。高糖誘導的線粒體功能失衡可能促進了心肌細胞凋亡事件的發生,這可能是高糖誘導心肌細胞受損的分子機制之一。本研究可能為糖尿病心肌病的發生發展提供理論依據。

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High glucose induces mitochondrial dysfunction in H9C2 rat cardiomyocytes

ZUO Jun1,WU Xia2*,TANG Zhiming3
(1DepartmentofInternalMedicine,FourthPeople’sHospitalofShaanxiProvince,Xi’an710043,China;2DepartmentofInternalMedicine,NorthwestWomenandChildrenHospitalofShaanxiProvince;3DepartmentofInternalMedicine,People’sHospitalofBaqiaoDistrictofXi’anCity;*Correspondingauthor,E-mail:1070907222@qq.com)

ObjectiveTo explore the effect of high glucose on mitochondrial dysfunction in H9C2 rat cardiomyocytes and the molecular mechanism of high glucose-related cardiomyopathy.MethodsH9C2 rat cardiomyocytes were divided into low concentration group(5 mmol/L glucose),moderate concentration group(15mmol/L glucose) and high concentration group(30 mmol/L glucose).After treatment with glucose for 12 h,the cell viability was measured by CCK-8,the level of mitochondrial ROS was detected by mitochondrial ROS fluorescence probe,the mitochondrial membrane potential was examined by JC-1,and the related proteins levels in H9C2 rat cardiomyocytes were analyzed by Western blot.ResultsCompared with low concentration group,the cellular viability decreased by 14.5 percentage in moderate concentration group(P<0.05) and 26.3 percentage in high concentration group(P<0.01).Compared with low concentration group,the level of mitochondrial ROS was increased in moderate concentration group(P<0.05) and high concentration group(P<0.01).Mitochondrial membrane potential of H9C2 rat cardiomyocytes maintained a high level in low concentration group,while mitochondrial membrane potential significantly decreased in moderate concentration group and high concentration group.Compared with control group,the expression of Bax/Bcl-2,cytoplasmic Cyt C and cleaved caspase-3 were significantly increased in moderate concentration group(P<0.05) and high concentration group(P<0.01).ConclusionHigh glucose-induced mitochondrial dysfunction may contribute to the decrease of cellular viability,suggesting that the mitochondrial dysfunction induced by high glucose might be responsible for the development of high glucose-related cardiomyopathy.

high glucose； H9C2； cardiomyocytes； mitochondria dysfunction

陜西省科學技術攻關課題資助項目(2010K 18-H1-6)

左軍,男,1976-生,碩士,主治醫師,E-mail:244059348@qq.com

2016-12-29

R589.1

A

1007-6611(2017)05-0405-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.001