新型Rho激酶抑制劑FSD-C10對A53T細胞突起的作用

趙 靜 張 偉 馬 杰 張海飛 尉杰忠△ 柴 智 宋麗娟 肖保國 馬存根1，2，△

1)山西醫科大學第一臨床醫學院神經內科 太原 030001 2)山西大同大學腦科學研究所 大同 037009 3)山西中醫學院神經生物學研究中心 太原 030024 4)復旦大學華山醫院神經病學研究所 上海 200025

·論著·

新型Rho激酶抑制劑FSD-C10對A53T細胞突起的作用

趙 靜1，2)張 偉1，2)馬 杰1，2)張海飛2)尉杰忠2)△柴 智3)宋麗娟3)肖保國4)馬存根1，2，3)△

1)山西醫科大學第一臨床醫學院神經內科 太原 030001 2)山西大同大學腦科學研究所 大同 037009 3)山西中醫學院神經生物學研究中心 太原 030024 4)復旦大學華山醫院神經病學研究所 上海 200025

目的 探討新型Rho激酶抑制劑FSD-C10對A53T細胞突起的影響及其促進突起生長的機制。方法 A53T細胞進行常規培養和傳代，細胞生長到90%左右后，根據不同實驗的需要，分為PBS陰性對照組、Fasudil陽性對照組及FSD-C10干預組。應用Image-Pro Plus v6.0軟件測量不同時間各組細胞突起的長度，Western blot檢測突起相關蛋白synapsinⅠ、synaptophysin、PSD-95的表達情況。結果 FSD-C10促進A53T細胞突起的生長，synapsinⅠ蛋白表達升高。結論 FSD-C10可能通過誘導synapsinⅠ的表達實現對突起生長的促進作用。

FSD-C10；A53T細胞；突起；synapsinⅠ

Fasudil作為目前臨床唯一使用的Rho激酶(ROCK)抑制劑，自1996年在日本用于動脈瘤破裂后遲發性血管痙攣臨床治療以來，目前已被廣泛用于多種與血管痙攣相關疾病的治療。ROCK是近10 a來發現參與細胞諸多活動的主要酶之一。已有研究表明，ROCK可在諸多神經系統疾病中被異常激活，在一些腦卒中、炎性脫髓鞘和炎性變性病等疾病發生發展的病理過程中扮演重要角色。ROCK抑制劑則可有效改善MS[1]及PD[2]動物模型的臨床癥狀。近年來，越來越多的證據表明，Fasudil還可促進神經細胞軸突再生，激發神經干細胞的分化潛能，促進其分化為少突膠質細胞，并在EAE模型中顯示其良好的治療潛能[3-5]。然而，由于Fasudil口服生物利用度差，安全窗相對較小，不宜長期使用，限制了諸多慢性進行性神經元變性疾病的治療。FSD-C10是基于Fasudil為母板合成的新型Rho激酶抑制劑衍生物。本研究利用A53T細胞探討FDS-C10對突起生長的影響，并觀察對突起相關蛋白synapsinⅠ、synaptophysin、PSD-95的表達。

1 材料與方法

1．1 材料 A53T細胞由復旦大學神經病學研究所肖保國教授惠贈。胎牛血清、DMEM高糖培養液、雙抗購自Gibco公司，MTT購自美國Sigma公司，多克隆兔抗突觸素Ⅰ抗體、鼠SYP單克隆抗體、兔PSD-95多克隆抗體、HRP-標記山羊抗鼠二抗購自Santa Cruz公司，HRP-標記山羊抗兔二抗購自北京博奧森公司，ECL化學發光試劑盒購自Invitrogen公司。

1．2 方法

1．2．1 細胞的培養和分組：A53T細胞復蘇后，接種于10 cm2的培養皿中，在含有10%胎牛血清、1%雙抗(100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)的高糖DMEM培養液中進行常規培養和傳代。細胞生長到約90%密度后，根據不同實驗的需要，傳代接種于新的10 cm2的培養皿中，同時分為PBS陰性對照組、Fasudil陽性對照組、FSD-C10干預組。首先，Fasudil陽性對照組、FSD-C10干預組分別加入Fasudil、FSD-C10，使其培養液含有終濃度為15 μg/mL的Fasudil、FSD-C10；然后將A53T細胞置5% CO2、37 ℃培養箱繼續培養，于4 h、72 h分別收集細胞。重復進行3次相同的獨立實驗。

1．2．2 細胞突起長度的測量：細胞培養至1 h、2 h、4 h、8 h、24 h，顯微鏡下分別觀察各組細胞。采用簡單隨機抽樣的方法，隨機挑選3個視野進行拍照，應用Image-Pro Plus v6.0軟件測量細胞突起的長度。

1．2．3 Western blot分析：細胞收集后，按100 mg 樣品加入0.2 mL預冷裂解液 A (40 mmol/L Tris，1%二硫蘇糖醇，蛋白酶抑制劑混合物，內含1 mmol/L苯甲基磺酰氟，1 mmol/L乙二胺四乙酸，0.7 μg/mL 抑肽素，0.5 μg/mL 亮肽素)勻質化，10 000 r/min、10 min、4 ℃離心混合物，將上清轉移到干凈無菌的離心管中，檢測蛋白含量(bicinchoninio acid，BCA)。待調整濃度后，分裝置-80 ℃保存。30 μg蛋白經SDS-PAGE 電泳和轉膜后，用5%牛奶封閉1 h，加入一抗(突起相關蛋白1∶500，內參 1∶10 000)4 ℃過夜。次日用PBS-T洗滌后，加入HRP-偶聯的相應二抗(1∶1 000)室溫2 h。再次洗滌后，條帶經化學發光試劑(ECL)反應后，采用化學發光檢測系統(Bio-Rad公司，Hercules，CA，美國)、圖像測量軟件(Bio-Rad實驗室，Hercules，CA，美國)比較目標蛋白與內參蛋白比值，進行半定量計算。

2 結果

2．1 FSD-C10對A53T細胞突起生長的影響 FSD-C10處理后，細胞突起的平均長度在培養1、2、4、8、24 h時明顯長于PBS組(P<0.05)，1、2、4 h時短于Fasudil組(P<0.01)，8、24 h長于Fasudil組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、圖2。

圖1 A53T細胞在Fasudil、FSD-C10作用0、1、2、4、8、24 h的細胞形態

圖 2 Fasudil和FSD-C10不同時間對A53T細胞突起長度的影響

2．2 FSD-C10對synapsinⅠ表達的影響 如圖3所示，Fasudil及FSD-C10在4 h作用后均不能誘導synapsinⅠ的表達，而72 h時Fasudil誘導synapsinⅠ的上調，但差異無統計學意義(P>0.05)，FSD-C10可顯著誘導synapsinⅠ的表達(P<0.05)，提示FSD-C10誘導synapsinⅠ表達的能力優于Fasudil。

2．3 FSD-C10對synaptophysin表達的影響 如圖4所示，Fasudil和FSD-C10無論在4 h或72 h作用后，均不能影響A53T細胞synaptophysin的表達；與對照組相比，synaptophysin的表達無明增加或減少。

圖3 Fasudil和FSD-C10誘導synapsinⅠ的表達

圖4 Fasudil和FSD-C10誘導synatophysin的表達

2．4 FSD-C10對PSD-95表達的影響 如圖5所示，Fasudil和FSD-C10作用A53T細胞4 h后，均可輕度誘導PSD-95的表達，雖差異尚未達到統計學意義。然而，Fasudil及FSD-C10作用A53T細胞72 h后，均可輕度抑制PSD-95的表達，但差異也未達到統計學意義。提示ROCK抑制劑Fasudil或FSD-C10作用早期可促進PSD-95表達，而在作用晚期則可抑制PSD-95表達。

圖5 Fasudil和FSD-C10誘導PSD-95的表達

3 討論

突觸素(synapsin)是一種磷酸蛋白，與突觸囊泡相連，是突觸小泡特異性的外側膜蛋白，在神經分化的早期及突起形成的過程中，每種突觸素都有其特異性作用，且在大腦各區的每個發育階段，突觸素在腦結構形成的過程中及其結構和功能可塑性都是必不可少的。突觸素家族包括突觸素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，其中突觸素Ⅰ(synapsinⅠ)是囊泡的外側膜蛋白。有研究利用基因敲除小鼠發現，在神經發育過程中，突觸素發揮了重要作用，參與中樞神經系統(central nervous system，CNS)突觸連接的形成和維持。敲除突觸素Ⅰ基因后，雖小鼠發育仍正常，且解剖學上無明顯異常，但在其腦內結構海馬CA3區的突觸前結構，神經末端明顯縮小，且活性區突觸囊泡減少，可見突觸形成明顯延遲[6-7]。有研究發現，敲除小鼠的突觸素Ⅰ基因，小鼠的突觸形成受阻[8-9]。本實驗將Fasudil及FSD-C10分別添加到A53T細胞的培養液中，觀察細胞突起生長情況，經Fasudil及FSD-C10處理的細胞突起的平均長度長于PBS組，說明Fasudil及FSD-C10具有促進A53T細胞突起生長的作用，而Fasudil及FSD-C10對synapsinⅠ的表達呈現誘導作用，且在后期FSD-C10誘導synapsinⅠ表達的能力優于Fasudil，表明Fasudil及FSD-C10通過誘導突觸素Ⅰ的表達實現對突起生長的促進作用。而在早期Fasudil作用的細胞突起生長平均長度長于FSD-C10作用的細胞，而后期FSD-C10作用后細胞突起生長平均長度長于Fasudil作用的細胞。因此，FSD-C10在具有Fasudil作用優點的同時，長期作用可能比Fasudil更穩定或有效。

突觸體素(synaptophysin)是一種位于突觸前膜的囊泡蛋白，與突觸的結構可塑性和功能可塑性密切相關[10]。本實驗中，在Fasudil及FSD-C10的作用下，與PBS組相比，未見synaptophysin的表達顯著增加或減少，結果顯示，Fasudil及FSD-C10盡管可促進細胞突起的形成，但似乎可能并不通過突觸體素的作用實現。

PSD是一層均質的致密物質，位于突觸后膜內側胞質面，包含多種蛋白質，突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density protein-95，PSD-95)是其主要蛋白質成分之一，在突觸可塑性中起重要作用。突觸可塑性是指突觸的形態和功能發生較為持久改變的特性或現象，是學習記憶形成的神經生理學基礎[11]，包括功能可塑性和結構可塑性兩大部分[12]。PSD-95為突觸后膜的標記蛋白，對維持樹突棘的穩定具有重要作用[13]。本實驗中，Fasudil及FSD-C10早期略可誘導PSD-95的表達，后期Fasudil及FSD-C10似乎抑制了PSD-95的表達，表明PSD-95在突觸結構形成的早期及維持其結構的穩定中起作用。但突觸形成后是否降解或轉化為其他蛋白有待進一步研究。

綜上所述，與Fasudil比較，FSD-C10也可有效促進A53T細胞突觸生長，其完整和準確的機制尚未闡明。然而，我們的結果提示，Fasudil和FSD-C10促進細胞突起形成可能與突觸素Ⅰ的誘導相關，而與突觸體素無關；同時，Fasudil和FSD-C10對PSD-95的作用，早期表現為誘導，晚期則為抑制。此外，本研究還顯示，FSD-C10對突觸素的作用可能優于Fasudil，因此有必要對FSD-C10化合物進行深入研究，以便為今后臨床治療相關疾病，如腦卒中、炎性脫髓鞘和炎性變性病提供實驗依據。

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(收稿2017-03-23)

The effect of novel Rho kinase inhibitor FSD-C10 on neurite of A53T cell

Zhao Jing﹡，Zhang Wei，Ma Jie，Zhang Haifei，Yu Jiezhong，Chai Zhi，Song Lijuan，Xiao Baoguo，Ma Cungen

﹡Department of Neurology，the First Clinical Medical College，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

Objective To investigate the effect of novel Rho kinase inhibitor FSD-C10 on neurite of A53T cell and its possible mechanism of the neurite outgrowth．Methods A53T cells were routinely cultured and divided into three groups：PBS group，Fasudil group and FSD-C10 group．The neurite length of A53T cells was measured by Image-Pro Plus v6.0 at different time points．The expressions of synapsinⅠ，synaptophysin and PSD-95 protein were examined by Western blot．Results Fasudil and PSD-C10 promoted neurite outgrowth of A53T cells．The expression of synapsinⅠ protein in A53T cells was increased，especially in FSD-C10-treated A53T cells．Both Fasudil and FSD-C10 slightly stimulated the PSD-95 at early state，but inhibited it at late state．Conclusion FSD-C10 can promote neurite outgrowth of A53Tcells possibly by its effect on the expression of synapsinⅠ protein．

FSD-C10；A53T cells；Neurite；SynapsinⅠ

國家自然科學基金2012年面上項目(81272163)；山西省回國留學人員重點科研資助項目(2014-重點7)；山西中醫學院“2011”培育計劃項目(2011PY-1)

R-33

A

1673-5110(2017)11-0001-04

△通訊作者：尉杰忠(1977-)，在讀博士，副教授，碩士生導師；馬存根(1960-)，博士，教授，博士生導師，E-mail：macungen2001@163.com