探針藥物法評價苦碟子注射液對大鼠肝微粒體CYP3A4的體外抑制作用

鄭造乾駱瑾瑜陳燕華王小軍

探針藥物法評價苦碟子注射液對大鼠肝微粒體CYP3A4的體外抑制作用

鄭造乾駱瑾瑜陳燕華王小軍

目的觀察苦碟子注射液對大鼠肝微粒體CYP3A4的體外抑制作用與CYP3A4酶底物合用藥時可能產生的相互作用。方法采用SD大鼠肝微粒體體外孵育法，設陰性對照組、陽性抑制劑對照組和苦碟子注射液組。利用高效液相色譜法測定底物睪酮的減少量，計算得到IC50,評價苦碟子注射液對大鼠肝微粒體CYP3A4酶的抑制活性，以酮康唑為陽性對照藥。結果在體外人肝微粒體孵育體系中，當Tris-HCl緩沖液濃度為0.1mol/L，pH為7.4，溫度為37℃時，睪酮最佳反應底物濃度為100μmol/L，最佳孵育時間為40min，最佳蛋白濃度為0.5mg/mL。陽性抑制劑酮康唑的IC50值為0.0707μmol/L，表明孵育體系滿足CYP3A4酶抑制活性的評價要求。9個不同體積終濃度（0、0.01%、0.10%、0.20%、0.50%、1.00%、2.00%、5.00%、10.00%）的苦碟子注射液對CYP3A4酶的相對抑制率分別為0，2.94%、16.44%、22.70%、31.44%、37.47%、46.37%、51.74%和60.40%，半數抑制率IC50值為3.46%，高于其日用藥量濃度。結論在體外正常劑量下，苦碟子注射液對人CYP3A4無明顯抑制作用，可以與其底物聯合用藥。

苦碟子注射液；鼠肝微粒體；CYP 3A4；抑制作用

苦碟子注射液（kudiezi injection，KDZi）是以菊科苦荬菜屬抱莖苦荬菜[ixeris sonchifolia（Bunge）Hance]的全草為原料提取精制而成的靜脈注射劑，其主要成分為黃酮、有機酸、倍半萜內酯以及核苷類成分[1-2]，具有改善微循環、抗血小板凝聚、降血脂和抗腫瘤等作用[3]。臨床常用于冠心病、心絞痛、腦梗死治療。合并用藥非常普遍、復雜[4-5]。細胞色素P450（CYP450）酶是人體內重要的藥物代謝酶，參與臨床約75%的藥物代謝，其中CYP3A4約占50%，其被抑制或誘導會影響藥物的體內過程，從而出現嚴重的藥物相互作用。本研究采用大鼠肝微粒體混合酶體外代謝體系，以睪酮為探針藥物，通過HPLC測定CY P3A4酶探針底物睪酮的減少量，評價KDZi對CYP3 A4酶活性的影響，以評估和預測其與CYP3A4底物合用時產生藥物相互作用的可能性和影響。

1 實驗材料

1.1 動物雄性SD大鼠6只，由浙江省中醫藥研究院實驗動物中心提供，動物許可證號：SXCK（浙）-0010755，清潔級，體質量（200±20）g；實驗動物飼料由浙江省實驗動物中心提供，參考GB 14924.1-2001《實驗動物配合飼料通用質量標準》[6]；實驗動物房使用許可證號為SYXK（浙）2014-0003，溫度為23±2℃，濕度為（50±10）%；實驗動物實驗前在動物房中適應7天，每籠2只，自由進食和飲水。

1.2 儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（Agilent，USA），配有在線脫氣機、四元梯度洗脫泵、柱溫箱、DAD檢測器及ChemStation化學工作站；Spectrum lab 52型紫外分光光度儀（上海棱光技術有限公司）；純水儀（PURELAB Ultra Genetic，英國ELGA公司）；超低溫冰箱（-80℃ULT Freezer，Thermo Forma公司）；渦旋震蕩儀GBL-88B（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；臺式高速冷凍離心機（Centrifuge 5415，Eppendorf公司）；超高速離心機（OptimaTM MAX-XP Ultracentrifuge，貝克曼庫爾特實驗系統有限公司）。

1.3 藥品與試劑苦碟子注射液（KDZi）（批號：140915，規格：10mL，沈陽雙鼎制藥有限公司）；苯巴比妥鈉注射液（批號140614，規格：0.1g/mL，上海新亞藥業有限公司）；睪酮、異枸櫞酸、異枸櫞酸脫氫酶、氧化/還原型輔酶Ⅱ（β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP/β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphatereduced form，NADPH）均購自美國Sigma公司；牛血清白蛋白購自杭州四季青生物工程材料有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，購自上海凌峰化學試劑公司；其余試劑均為國產分析純。

2 實驗方法

2.1 大鼠肝微粒體的制備按照文獻[7]方法采用差速離心法制備大鼠肝微粒體。選取雄性SD大鼠6只，連續3天腹腔內注射102mg/（kg·d）苯巴比妥鈉注射液，于末次給藥后將大鼠禁食24h并拉頸處死，開腹取出肝臟并用濾紙吸干水分、稱重；立即于4℃的蔗糖溶液中清洗并用剪刀剪碎，反復清洗至無血色；按1g∶4mL加入0.25mol/L蔗糖溶液，在冰浴中用組織勻漿機制成勻漿并超聲分散30s；在4℃下，9000×g離心20min，取上清液，19 000×g離心20min，然后100 000×g離心55min；去除上清液，取沉淀用0.15mol/L的KCl懸浮均勻，然后100 000×g離心45min，取沉淀（肝微粒體）；最后將所得肝微粒體懸浮于20mmol/ mL的Tris-sucrose（pH7.4）緩沖液，并置于-80℃保存備用。以上操作均在4℃以下進行。用考馬斯亮藍法（Bradford法）測定肝微粒體的蛋白濃度[8]。

2.2 肝微粒體體外孵育體系參照文獻[9]方法建立終體積為200μL的孵育體系，包括終濃度為14.9 mmol/L的異枸櫞酸（isocitric acid），0.035unit/mL異枸櫞酸脫氫酶（isocitric dehydrogenase），0.15mol/L的MgCl2，0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH=7.4），0.5mg/ mL的大鼠肝微粒體蛋白，100μmol/L的探針底物睪酮和20μL系列濃度的苦碟子注射液（終濃度為0，0.01%，0.10%，0.20%，0.50%，1.0%，2.0%，5.0%，10.0%）或酮康唑溶液（終濃度0.001，0.010，0.050，0.100，1.0 00，5.000，10.000，20.000μmol/L）。37℃恒溫水浴振蕩預孵育3min后，加入2μL NADP/NADPH[（0.27mmol/ L）/（0.12mmol/L）]的1%NaHCO3溶液啟動反應，孵育40min后，用200μL的冰乙腈終止反應。渦旋震蕩1min，13 000r/min離心10min，取上清液用0．22μm有機微孔膜過濾，用HPLC測定探針底物睪酮的濃度。每個濃度3個平行樣品。計算KDZi對CYP 3A4的抑制率及IC50值。整個孵育體系控制有機溶劑的體積濃度在＜1%。

2.3 HPLC檢測探針底物睪酮濃度色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax C18（200mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-水溶液（53∶47）；流速1.0mL/min，柱溫30℃，波長245nm，進樣量50μL。

2.4 CYP酶抑制作用的評價以IC50（50%inhibitory concentration）值為指標，IC50為藥物在產生50%抑制作用時的藥物濃度。其值越小，表明藥物的抑制作用越強。IC50值計算如下：通過測定探針底物的剩余量確定CYP酶的抑制率。抑制率（%）=（不同體積濃度苦碟子組測得的探針底物睪酮量-陰性對照組測得的探針底物睪酮量）/陰性對照組測得的探針底物睪酮量×100%。

2.5 統計學方法每個數據為每組單獨實驗至少重復3次的平均值。用GraphPad Prism6.0軟件將剩余活性對藥物濃度的對數值作圖計算IC50。采用SPSS17.0統計軟件，所有實驗數據均以表示。

3 實驗結果

3.1 HPLC測定睪酮的方法學考察在2.3色譜條件下，大鼠肝微粒體孵育體系按2.2項處理后，上清液中各物質、KDZi中各成分與睪酮達到基線分離，不干擾測定。睪酮的出峰時間在6.064min，以睪酮濃度為橫坐標（C），峰面積為縱坐標（AUC），得標準曲線：AUC=46.985C+13.75，R2=0.9993（n=10），在0.2～200μmol/L的濃度范圍內線性關系良好，0.1、50、200μmol/L 3個濃度的睪酮的日內和日間RSD分別＜8%和7%，提取回收率95.6%～103.5%，符合回收率在95%～105%的測定要求。

3.2 睪酮體外代謝條件考察及優化最佳肝微粒體體外溫孵條件：體外肝微粒體混合酶系中，當Tris-HCl緩沖液濃度為0.1mol/L，pH為7.4，溫度為37℃時，睪酮最佳反應底物濃度為100μmol/L，最佳孵育時間為40min，最佳蛋白濃度為0.5mg/mL。

3.3 大鼠肝微粒體孵育體系的驗證由酮康唑對CYP 3A4的抑制曲線計算得到IC50值。根據通用CYP酶抑制強度分級規則[10]，IC50＜1μmol/L為強抑制劑，1μmol/L＜IC50＜10μmol/L為中等強度抑制劑，IC50＞10μmol/L為弱抑制劑。首先用陽性抑制劑酮康唑驗證了大鼠肝微粒體孵育體系。酮康唑對CYP3A4表現出明顯的抑制作用，其IC50值為0.0707μmol/L，見圖1，符合參考文獻范圍（0.0238～0.0954）[11]，表明孵育體系滿足CYP3A4酶抑制活性的評價要求。

3.4 不同濃度苦碟子注射液對CYP3A酶活性的影響苦碟子注射液的原液分別取9個不同的體積終濃度（V/V），以陰性對照組活性為100%，計算KDZi不同體積終濃度的抑制率，相對百分活性=1-抑制率（%），用GraphPad Prism v6.0軟件按照非線性回歸計算出KDZi的IC50值為原液的3.46%，見圖2。KDZi對睪酮代謝的影響見表1。

圖1 不同濃度酮康唑溶液對CYP3A4酶抑制活性的影響

圖2 不同濃度KDZi對CYP3A4酶抑制活性的影響

表1 不同濃度苦碟子注射液對睪酮代謝的影響

表1 不同濃度苦碟子注射液對睪酮代謝的影響

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4 討論

目前，中-西藥聯用非常普遍，但是大部分中藥安全性和有效性的科學證據非常有限[12]。同藥物-藥物相互作用（Drug-Drug interaction，DDIs）一樣，中藥與中藥之間、中藥與西藥之間也有潛在藥物相互作用，從而導致藥物不良反應和藥物不良事件，包括增加肝腎毒性、不正常出血、移植排斥和心血管崩潰等[13-14]，許多中藥是CYP450酶的底物、誘導劑和/或抑制劑，其中CYP3A4參與了市場上50%左右藥物的代謝。一般而言，酶抑作用所致的代謝性相互作用的臨床意義大于酶促作用。因此，考察藥物對CYP3A4酶的抑制作用，有助于評價藥物安全性，預測潛在的藥物相互作用，指導臨床合理用藥。

由于中藥注射劑的成分極其復雜，不能采用計算IC50通用的μmol/L單位，但苦碟子注射液通常通過靜脈滴注給藥，我們根據文獻采用體積百分濃度計算IC50的方法[15]，采用將不同體積的KDZi的原液加入到微粒體孵育體系中進行孵育，通過測定底物睪酮的剩余量，計算出苦碟子注射液對CYP3A4的IC50為3.46%。KDZi說明書推薦劑量為10～40mL/次，1天1次，以正常人血漿容量為5000mL計算，苦碟子在人體內的濃度為0.20%～0.80%，遠低于KDZi的半數抑制濃度3.46%。以上結果顯示，在正常使用劑量下，KDZi對大鼠肝微粒體CYP3A4幾乎未顯示抑制作用。因此，我們推測KDZi對CYP3A4酶產生有臨床意義的抑制作用的可能性很小。

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（收稿：2016-09-01修回：2016-09-23）

In vitro Inhibition of Kudiezi Injection on Rat Liver Microsomal CYP3A4 Using A Probe Drug

ZHENG Zaoqian1,LUO Jinyu2,CHEN Yanhua1,WANG Xiaojun1.1 Department of Pharmacy,2 Division of Nephrology, Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

ObjectiveTo investigate the in vitro inhibition of kudiezi injection（KDZi）on liver microsomal CYP3A4 in rats and the potential herb-drug interaction with drugs metabolized by CYP3A4 enzyme in clinical application.MethodsThe test groups included a negative control group,an inhibitor positive control group and a KDZi group.After incubating the rat liver microsomes with testosterone,a probe substrate,the reduction of testosterone were quantitated with HPLC,and IC50 values were calculated to assess the inhibitory effect of KDZi on rat CYP3A4 enzyme.Ketoconazole was used as a positive control.ResultsIn mixture metabolic system of liver microsome enzymes,the most suitable incubation concentration of testosterone was 100μmol/L,incubation time was 40 min and concentration of microsome protein was 0.5mg/mL,when the concentration of Tris-HCl buffer was 0.1mol/L（pH7.4）at 37℃.The results showed that the IC50 value of positive inhibitors of CYP3A4 was 0.0707μmol/L, which indicated that the incubation system satisfied the demands of CYP3A4 enzyme inhibition activity evaluation. The relative inhibitory rate of CYP3A4 in 9 serial volume concentration of KDZi（0,0.01%,0.10%,0.20%, 0.50%,1.00%,2.00%,5.00%,10.00%）were 0,2.94%,16.44%,22.70%,31.44%,37.47%,46.37%,51.74%,and 60.40%,respectively.The IC50 value of KDZi on CYP3A4 inhibition was 3.46%,which was exceeded their dailydose concentration.ConclusionIn ordinary condition,no significant interaction between KDZi and CYP3A4 is detected in vitro,which indicates that KDZi might be used with CYP3A4 enzyme substrates.

kudiezi injection;rat liver microsomes;CYP3A4;inhibitory effect

浙江省中醫藥科技計劃項目（No.2013ZB012）

浙江省立同德醫院藥學部（鄭造乾、陳燕華、王小軍）、血液凈化中心（駱瑾瑜）（杭州310012）

鄭造乾，Tel：13857143823；E-mail：zhengzaoqian@163.com