當歸對膠原性關節炎模型大鼠血清MCP-1、MMP-3的影響

劉建方趙國強

當歸對膠原性關節炎模型大鼠血清MCP-1、MMP-3的影響

劉建方趙國強

目的觀察當歸對膠原性關節炎（CIA）模型大鼠血清單核細胞趨化因子-1（MCP-1）、基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）的影響。方法清潔級Wistar大鼠30只，隨機分為空白對照組、膠原性關節炎（CIA）模型組、甲氨蝶呤組和當歸低、高劑量組，每組6只。除空白對照組外，采用Ⅱ型膠原免疫法制備膠原性關節炎模型。、甲氨蝶呤組每次給藥1mg/kg，每周2次，腹腔注射；當歸低、高劑量組分別灌飼當歸煎液0.75g（kg·d）和1.5g（kg·d），空白對照組和模型組灌飼等量生理鹽水，持續3周。觀察大鼠血清MCP-1、MMP-3及大鼠關節腫脹指數。結果造模后，各藥物組大鼠血清MCP-1、MMP-3均明顯升高（P＜0.05）。與CIA模型組比較，甲氨蝶呤組、當歸高劑量組大鼠MCP-1均有降低[（139.20±11.69）pg/mL、（151.64±13.42）pg/mL比（179.21±13.79）pg/mL，P＜0.05]；甲氨蝶呤組、當歸高劑量組大鼠MMP-3均有降低[（1.57±0.19）ng/mL、（1.69±0.21）ng/mL比（2.04±0.27）ng/mL，P＜0.05]；甲氨蝶呤組、當歸高劑量組的大鼠關節腫脹評分均有降低[（2.83±0.41）分、（3.33±0.52）分比（3.83± 0.41）分，P＜0.05）]。結論當歸能不同程度降低膠原性關節炎大鼠血清MCP-1、MMP-3含量，且同時減輕大鼠關節腫脹指數。

大鼠；膠原性關節炎；當歸；MCP-1；MMP-3；關節腫脹指數

類風濕性關節炎是一種以慢性多關節炎癥為主要表現的自身免疫性疾病，最終常致關節畸形[1-2]。單核細胞趨化因子-1（MCP-1）、基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）作為重要的細胞炎癥參與因子，在機體免疫性疾病中扮演重要的角色。筆者通過觀察當歸煎液對大鼠膠原性關節炎（CIA）血清MCP-1、MMP-3的變化，了解當歸對類風濕關節炎可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康清潔級Wistar大鼠30只，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2013-0180，體質量220～250g，由浙江大學醫學院附屬第一醫院動物實驗中心提供并常規飼養。大鼠分籠飼養,每籠6只，室溫20～22℃，通過自動換氣裝置調節室內空氣，人工調節熒光照明，每天明暗各12h，常規全價飼料喂養，自由飲食、飲水。

1.2 藥物及主要試劑當歸購自浙江中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，取當歸500g，加適量蒸餾水浸30min，煮沸10min后小火再30min，過濾；殘渣再次加蒸餾水煮沸，再小火30min，反復3～4次，濃縮至100mL。最后用蒸餾水調制到1000mL，制成每毫升含0.5g生藥的當歸煎液。依照人體單位體質量生藥量求得大鼠的單位體質量生藥量,4℃冰箱保存備用。Ⅱ型膠原：美國sigma試劑公司，批號（060069）；不完全弗氏佐劑：美國sigma試劑公司，批號（104K8926）；MCP-1序列號（CSB-E08478r）、MMP-3ELISA序列號（CSB-E08534r）試劑盒：由美國ADL公司分裝，杭州方順生物技術有限公司提供，。

1.3 動物模型建立SD大鼠適應性喂養1周后，采用Ⅱ型膠原誘導法制備CIA模型[3]：將Ⅱ型膠原溶解于0.1mol/L的冰乙酸中制備Ⅱ型膠原溶液（終濃度為2g/L），將Ⅱ型膠原溶液滴加至冷的等體積不完全弗氏佐劑中，充分乳化。于第1天及第7天下午3時進行Ⅱ型膠原乳化劑注射，醫用酒精消毒后每只大鼠尾部多點注射，每點約0.1mL，注射總量0.5mL。術后注意創面消毒，保持清潔。空白對照組給予生理鹽水注射，其他操作同造模組。

1.4 動物分組與給藥SD大鼠30只按數字隨機表法隨機分為空白對照組、膠原性關節炎（CIA）模型組、甲氨蝶呤組、當歸低劑量組和當歸高劑量組，每組6只。CIA造模成功后1周開始給藥。空白對照組及CIA模型組每日給予等量生理鹽水；甲氨蝶呤組每周周一、周四上午9時給予甲氨蝶呤1mg/kg，腹腔內注射；當歸低劑量組每日上午9時予0.5g/mL當歸煎液0.75g灌飼；當歸高劑量組每日9時和16時灌飼當歸煎液0.75g/d，各1次。各組均連續給藥3周。

1.5 標本制備與指標檢測（1）給藥前及給藥過程中記錄各組大鼠的關節腫脹部位及程度，采用腫脹指數評分系統[4]進行評價。0分：無關節炎；1分：小趾關節輕度腫脹；2分：小趾關節和足跖腫脹；3分：踝關節以下的足爪腫脹；4分：包括踝關節在內全部關節腫脹。（2）血清標本制備：予2%戊巴比妥鈉（40mg/ kg）腹腔麻醉，仰臥固定，乙醇消毒后，緩慢抽取大鼠頸動脈血1mL，置于PE管中，3000r/min離心l0min，分離血清，于-70℃凍存，待全部實驗結束后采用ELISA法測定血清MCP-1、MMP-3含量，操作嚴格按照試劑說明書進行。

1.6 統計學方法應用SPSS17.0軟件進行統計處理，計量資料以均數±標準差表示，組間均數比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 當歸煎液對大鼠關節腫脹的影響與空白對照組比較，余四組大鼠關節腫脹評分增高（P＜0.05）；與CIA模型組比較，甲氨蝶呤組、當歸高劑量組大鼠關節腫脹評分均明顯降低（P＜0.05）；當歸低劑量組大鼠關節腫脹評分與CIA模型組比較有降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。當歸低、高劑量組關節腫脹指數均高于甲氨蝶呤組（P＜0.05）；低、高劑量當歸組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 四組大鼠給藥前后關節腫脹評分比較

表1 四組大鼠給藥前后關節腫脹評分比較

注：與CIA模型組比較，*P＜0.05；與甲氨蝶呤組比較，▲P＜0.05；與空白對照組比較；△P＜0.05；CIA：膠原性關節炎

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2.2 當歸煎液對大鼠血清MCP-1、MMP-3的影響與空白對照組比較，CIA模型組、甲氨蝶呤組及不同劑量當歸組大鼠血清MCP-1、MMP-3均明顯升高（P＜0.05）。與CIA模型組比較，甲氨蝶呤組、當歸高劑量組大鼠血清MCP-1、MMP-3明顯降低（P＜0.05）。當歸低劑量組血清MCP-1、MMP-3較CIA模型組降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與甲氨蝶呤組比較，當歸高、低劑量組血清MCP-1、MMP-3均升高（P＜0.05）。當歸低、高劑量組血清MCP-1、MMP-3比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

類風濕性關節炎為難治性自身免疫性疾病，如沒有有效治療，往往造成關節畸形和強直[5]。研究表明，類風濕性關節炎病程中，MCP-1等趨化因子在炎性細胞遷移、浸潤過程中起了重要作用[6]。大鼠膠原性關節炎模型，能夠很好模擬類風濕性關節炎的臨床特點和病理改變，因此常用它來證實某些臨床藥物對風濕性關節炎的治療機制和臨床效果[3]。

表2 各組大鼠給藥前后血清MCP-1、MMP-3水平比較

表2 各組大鼠給藥前后血清MCP-1、MMP-3水平比較

注：與空白對照組比較，△P<0.05；與CIA模型組比較，*P<0.05；與低劑量當歸組比較，#P<0.05；與甲氨蝶呤組比較，▲P<0.05；MCP-1：單核細胞趨化因子-1；MMP-3：基質金屬蛋白酶-3

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MCP-1是機體內一種常見的細胞趨化因子，主要通過促使炎性細胞特別是單核細胞等的遷移、浸潤，造成局部關節軟骨破壞、病變[7]。動物實驗表明[8-9]，將MCP-1注射到兔的關節內，滑膜上出現顯著的巨噬細胞浸潤；從類風濕性關節炎患者的滑膜液中也可檢測到高滴度的MCP-1，兩者均提示MCP-1是風濕性關節炎重要的致病性細胞因子。本研究顯示，CIA模型組在制模后3周血清MCP-1濃度明顯增加，說明MCP-1參與了膠原性關節炎的發生、發展。

基質金屬蛋白酶（MMPs）能使細胞外基質的所有蛋白成分降解，從而導致韌帶、軟骨及骨的破壞。MMPs的活化被認為是細胞外基質降解的限速環節[10]，機體組織內的金屬蛋白酶組織抑制劑可抑制MMPs的活性，從而保持一種動態平衡，一旦平衡打破，多種病理過程就會隨之產生[11]。MMP-3為基質金屬蛋白酶組的一種，與類風濕性關節炎關系最為密切，在晚期類風濕性關節炎患者的關節滑膜中，MMP-3的基因和蛋白均有過度表達，滑膜液中含有大量MMP-3，血清中濃度也明顯升高[12-14]。研究發現，CIA模型組在制模后3周，MMP-3血清平均值較空白對照組升高近一倍，提示MMP-3可能是疾病作用機制中的一個因子。而通過甲氨蝶呤和高劑量當歸的持續應用，大鼠MMP-3平均濃度均有明顯下降，說明當歸煎液能夠明顯減少膠原性關節炎大鼠中血清MMP-3的產生，從而抑制MMP-3對關節軟骨的進一步破壞。

當歸為多個中藥湯劑的主要成分，如當歸芍藥湯劑、當歸補血湯等。實驗結果顯示，當歸對機體多個系統有明顯的保護作用[15-17]，當歸水浸出液可顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能；其次，它還有非特異性的抗炎作用，包括對關節的急、慢性炎癥有顯著的抑制作用，降低炎性因子的含量，減少毛細血管的通透性，減輕水腫。以當歸為主的湯劑治療類風濕性關節炎可能正是通過以上途徑來阻止關節炎癥的發展，從而減輕和改善關節及全身癥狀。本組CIA制模后給予不同劑量的當歸煎液持續3周，不同程度減少大鼠關節腫脹，減輕組織水腫，關節腫脹指數較CIA模型組減少，能夠明顯減少參與關節炎癥的細胞趨化因子如MCP-1濃度。本實驗發現，高劑量當歸煎液組用藥后3周血清平均MCP-1較CIA模型組明顯下降（P＜0.05），提示高濃度當歸煎液能夠顯著減少MCP-1的產生。然而當歸高低劑量組與甲氨蝶呤組相比，MCP-1血清濃度還是明顯升高，顯示通過單一的當歸作用機制，很難完全控制住膠原性關節炎大鼠體內某些細胞因子水平，也不能阻斷疾病的繼續發展。但當歸作為湯劑的一個有效成分，是否能夠與中藥湯劑中的其他成分一起發揮作用，從而通過減少機體內基質金屬蛋白酶、細胞趨化因子等方法控制疾病，值得進一步研究。

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（收稿：2016-08-14修回：2016-10-09）

Effect of Chinese Angelica on MCP-1 and MMP-3 in Rats with Collagen-induced Arthritis

LIU Jianfang, ZHAOGuoqiang.DepartmentofOrthopedics,Children'sHospital,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity, Hangzhou(310051),China

ObjectiveTo investigate the effect of Chinese angelica on the expression of serum monocyte chemotactic protein 1（MCP-1）and matrix metalloproteinase-3（MMP-3）in collagen-induced arthritis（CIA）model rats.MethodsThirty Wistar rats were randomly divided into blank control group,CIA model group, methotrexate group,and low and high doses of Chinese angelica groups,with 6 rats in each group.Except for blank control group,CIA models were established in other four groups.Methotrexate group

methorexate intraperitoneally twice a week,1mg/kg.Chinese angelica decoction was given to rats by gavage at dose of 0.75g（kg· d）and 1.5g（kg·d）in low and high doses of Chinese angelica groups,respectively.Blank control group and model group were administered with equivalent volume of saline.The treatment course lasted for 3 weeks.The serum levels of MCP-1 and MMP-3 were observed and the swelling scores of rats'joints were calculated.ResultsThe serum MCP-1 and MMP-3 increased in all CIA rats（P<0.05）.Compared with model group,methotrexate group and high dose of Ch-inese angelica group had decreased serum MCP-1（139.20±11.69pg/mL,151.64±13.42pg/mL vs 179.21±13.79pg/mL,P<0.05）and serum MMP-3（1.57±0.19ng/mL,1.69±0.21ng/mL vs 2.04±0.27ng/mL,P< 0.05）,and lower swelling score of the joints（2.83±0.41,3.33±0.52 vs 3.83±0.41,P<0.05）.ConclusionChinese angelica can reduce the serum level of MCP-1 and MMP-3 and alleviate the swelling of the joints in rats with CIA.

rats;collagen-induced arthritis;Chinese angelica;MCP-1;MMP-3;joint swelling index

浙江省中醫藥科技計劃項目（No.2013ZA085）

浙江大學醫學院附屬兒童醫院骨科（杭州310051）

趙國強，Tel：13858020847；E-mail：friendlongzju@163.com