高效液相色譜法測定參味益氣口服液中五味子醇甲的含量

孔凡存　牛家豐　馬梅芳

【摘要】 目的 建立測定參味益氣口服液中五味子醇甲含量的高效液相色譜法（HPLC）。方法 色譜柱：Thermo-C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm）， 流動相：甲醇-水（65：35）；檢測波長：250 nm；流速：0.7 ml/min；柱溫：40℃。結果 五味子醇甲在12.4～124.0 μg， 線性關系良好， 加樣回收率99.03%， RSD=0.63%（n=6）。結論 該方法準確、穩定性好、重現性高， 易于操作， 可以作為控制參味益氣口服液質量的重要方法。

【關鍵詞】 高效液相色譜法；參味益氣口服液；五味子醇甲；含量測定

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.12.097

【Abstract】 Objective To establish a method by high performance liquid chromatography （HPLC） to determine schisandrin content in Shenwei Yiqi oral liquid. Methods Chromatographic column was Thermo-C18 （4.6 mm×150 mm， 5 μm）， with mobile phase as methyl alcohol-water （65：35）. Measurement wavelength was 250 nm， with flow velocity as 0.7 ml/min and column temperature as 40℃. Results Schisandrin showed excellent linear relation in 12.4～124.0 μg， with sample adding recovery rate as 99.03%， RSD=0.63% （n=6）. Conclusion This method is accurate with excellent stability， high reproducibility and easy operation， and it can be taken as an important method to control quality of Shenwei Yiqi oral liquid.

【Key words】 High performance liquid chromatography； Shenwei Yiqi oral liquid； Schisandrin； Content determination

參味益氣口服液為本院制劑， 收載于《山東省醫療機構制劑規范》第1版第1冊， 由人參、黃芪、五味子、天花粉四味藥物組成， 具有益氣斂陰、清熱生津、安神鎮靜之功效， 用于神經衰弱、病后體虛的治療。為進一步控制藥品質量， 本文探討該制劑中五味子醇甲的含量測定方法， 采用高效液相色譜法對其含量進行測定， 取得滿意的效果。

1 儀器與試劑

1. 1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津公司；LC—20AT liquid chromatograph；SPD—20A uv/vis detector；SIL—20A auto sampler；CTO—20A column oven；LC solution色譜工作站）；Thermo-C18色譜柱（4.6mm×150mm， 5 μm）；METTLER TOLEDO XS 205型分析天平（瑞士梅特勒公司）；純水機（美國Millipore公司；FOEA26810D型）。

1. 2 試劑 甲醇（色譜純， 天津大茂化學試劑有限公司）；水為新鮮制備的超純水；乙酸乙酯（分析純， 萊陽經濟技術開發區精細化工廠）；五味子醇甲對照品（批號：110857-200507）：購自中國食品藥品檢定研究院；參味益氣口服液樣品（批號20150501、20150502、20150503）；缺少五味子的陰性對照樣品（自制）。

2 方法與結果

2. 1 色譜條件[1] 色譜柱：Thermo-C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm）；流動相：甲醇-水（65：35）；檢測波長：250 nm；流速：0.7 ml/min；柱溫：40℃；理論塔板數按五味子醇甲峰計算不低于2000。

2. 2 檢測波長的選擇 精密稱取適量五味子醇甲對照品， 用甲醇溶解， 配成適宜濃度的五味子醇甲對照品甲醇溶液， 按照光譜法掃描， 發現五味子醇甲在250 nm波長處有最大吸收， 該吸收峰形良好， 適合做定量分析， 因此選擇250 nm作為檢測波長。

2. 3 對照品溶液的制備 精密稱取五味子醇甲對照品適量， 加適量甲醇溶解并定容， 制成25 μg/ml的五味子醇甲對照品溶液。

2. 4 供試品溶液的制備 精密量取參味益氣口服液樣品5 ml， 置分液漏斗中， 加乙酸乙酯20 ml振搖提取， 提取3次， 將乙酸乙酯提取液合并， 置水浴蒸干， 殘渣加適量甲醇溶解并分次轉移至25 ml量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 濾過， 取續濾液， 即得。

2. 5 陰性對照溶液的制備 取缺少五味子的陰性對照樣品， 按照供試品溶液的制備方法， 制備成陰性對照溶液。

2. 6 干擾試驗 吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl， 按照2.1項下的色譜條件， 分別注入液相色譜儀， 測定。參味益氣口服液供試品色譜中， 在與五味子醇甲對照品色譜相應的位置上， 有色譜峰出現， 而缺少五味子的陰性對照溶液在五味子醇甲色譜峰位置處無相應峰出現， 表明缺少五味子的陰性對照樣品中， 其他組分對五味子醇甲的測定無干擾。見圖1

甲

2. 7 線性關系考察 精密稱取五味子醇甲對照品12.4 mg， 置100 ml容量瓶中， 加甲醇溶解并定容至刻度， 搖勻， 作為五味子醇甲對照品貯備液（濃度為0.124 mg/ml）。分別精密量取五味子醇甲對照品貯備液1、2、4、6、8、10 ml， 置10 ml容量瓶中， 用甲醇溶解并定容至刻度， 搖勻， 作為6個濃度的五味子醇甲對照品溶液， 分別精密吸取10 μl， 注入高效液相色譜儀， 按上述色譜條件測定色譜峰面積， 以五味子醇甲進樣量C對吸收峰面積A進行線性回歸， 求得回歸方程為 A=15519C-3738（r=0.9999）。表明五味子醇甲在12.4～124.0 μg， 與吸收峰面積之間呈良好的線性關系。

2. 8 精密度實驗 精密吸取五味子醇甲對照品溶液（24.8 μg/ml）

10 μl， 按2.1項下色譜條件， 重復進樣6次， 色譜峰保留時間穩定， 測得五味子醇甲峰面積積分值分別為386154、386225、386094、386111、386358、386079， 平均值為386170， RSD=0.03%（n=6）。表面儀器的精密度良好。

2. 9 穩定性試驗 按照供試品溶液的制備方法制備一批供試品溶液（批號20150501）， 室溫下分別在制備后0、4、8、12、16、24 h進樣測定， 記錄色譜峰面積值分別為427566、427438、427110、427094、426995、426986， 平均值為427198， RSD=0.06%， 表明供試品溶液在室溫下 10 h內基本穩定。

2. 10 重現性實驗 對同一批參味益氣口服液（批號20150502）分別制備6份供試品溶液， 按照2.1色譜條件測定， 計算含量分別為0.1439、0.1433、0.1438、0.1432、0.1439 、0.1437 mg/ml， 平均值為0.144 mg/ml， RSD=0.22%（n=6）。表明方法的重現性良好。

2. 11 加樣回收率實驗 取已知五味子醇甲含量為0.144 mg/ml的參味益氣口服液9份， 分別精密加入一定量的五味子醇甲對照品， 按2.4項下供試品溶液制備方法操作， 依法制備供試品溶液， 進樣量10 μl， 測定， 按下列公式計算回收率。見表1。

2. 12 樣品含量測定 取三批參味益氣口服液樣品， 按2.4項下供試品溶液制備方法操作， 按2.1項下色譜條件， 依法測定。見表2。

3 討論

3. 1 五味子具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心之功效， 是本制劑中的主要藥材之一， 五味子醇甲是五味子的主要活性成分之一， 具有鎮靜、保護腦神經細胞等多方面的藥理作用[2-8]， 因此選擇五味子醇甲作為該制劑質量控制的指標， 既符合中醫藥君臣佐使配伍理論， 又能滿足現代中藥分析測試的要求， 科學合理， 可操作性強。

3. 2 實驗的研究階段， 作者從提取溶媒、提取條件等方面對供試品溶液的制備方法進行了優選。實驗結果表明， 乙酸乙酯萃取易于分層， 后續操作簡便；提取3次以后， 增加提取次數， 測得五味子醇甲含量不再增加；故確定供試品溶液的提取方法為乙酸乙酯萃取3次。

3. 3 實驗結果表明， 高效液相色譜法測定參味益氣口服液中五味子醇甲的含量， 結果準確、穩定性好、重現性高， 易于操作， 可以作為控制參味益氣口服液質量的重要方法。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中國藥典（一部）.北京：中國醫藥科技出版社， 2010：61-62.

[2] 南京中醫藥大學.中藥大辭典（上冊）.上海：上海科學技術出版社， 2006：518.

[3] 鈕心懿， 王維君， 邊振甲， 等. 五味子有效成分“醇甲”的中樞神經系統作用. 藥學學報， 1983（6）：416.

[4] 李海濤， 胡剛. 五味子醇甲抑制6-羥基多巴胺誘導PC12細胞凋亡的研究. 南京中醫藥大學學報自然科學版， 2004， 20（2）：96-98.

[5] 張蓉， 喬明. HPLC測定參味合劑中五味子醇甲的含量. 臨床合理用藥雜志， 2012， 5（8）：119-120.

[6] 何靜， 史國兵， 孫學惠. 高效液相色譜法測定復方參芪五味咀嚼片中五味子醇甲的含量. 山西醫藥雜志， 2011， 40（24）：1191-1192.

[7] 蔣受軍， 鄧鳴， 王思寰， 等. 高效液相色譜法測定人參蜂王漿口服液中五味子木脂素成分的含量. 中國生化藥物雜志， 2012， 33（6）：830-832.

[8] 蔣燕霞， 林榜建， 官柳. 高效液相色譜法測定心榮口服液中五味子醇甲含量. 現代醫藥衛生， 2012， 28（23）：3560-3561.

[收稿日期：2016-12-02]