1071例地中海貧血基因篩查結果分析

陳育華++周碧云++梁斯鍶++吳顯勁++李海燕

[摘要]目的 了解來我院就診的地中海貧血（簡稱“地貧”）篩查患者地貧基因類型并分析平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白含量（MCH）在地貧篩查中的應用價值。方法 對2015年12月～2016年9月來我院就診的1071例地貧篩查患者采用裂口PCR（gap-PCR）擴增法檢測α地貧基因以及PCR-反向斑點雜交（PCR-RDB）技術檢測β地貧基因，血細胞分析儀分析904例患者外周血的MCV、MCH。結果 ①1071例檢測樣本中男性556例，檢出地貧230例（41.37%）；女性515例，檢出地貧238例（46.21%），不同性別組檢測陽性差異無統計學意義（χ2=2.55，P>0.05）。②兒童組（0～16歲）360例，檢出地貧174例（48.33%）；青壯年組（17～49歲）651例，檢出地貧278例（42.7%）；老年組（≥50歲）60例，檢出地貧16例（26.67%），不同年齡組檢測陽性差異有統計學意義（χ2=10.48，P<0.01）。③1071例樣本共檢測α地貧293例（27.36%），其中以αα/--SEA、-α3.7/αα、αα/-α4.2基因型為主，占α地貧的93.86%；檢測β地貧157例（14.66%），其中以CD41-42、IVS-Ⅱ-654、-28、CD71-72、CD17基因型為主，占β地貧的82.81%；α地貧復合β地貧18例，比例為1.68%。④MCV用于α地貧、β地貧和αβ復合型地貧的篩查的靈敏度分別為91.18%、99.21%、92.31%，特異度為54.18%；MCH用于α地貧組、β地貧組和αβ復合型地貧組的篩查的靈敏度分別為94.12%、99.21%、100.00%，特異度為51.90%；MCV+MCH用于α地貧組、β地貧組和αβ復合型地貧組的篩查的靈敏度分別為89.08%、99.21%、84.62%，特異度為49.24%；MCV與MCH的靈敏度差異無統計學意義（χ2=1.77，P>0.05），特異度差異無統計學意義（χ2=0.55，P>0.05）。結論 1071例地貧患者中α地貧中以αα/--SEA基因型最為常見，β地貧中以βCD41-42基因型最為常見，在地貧篩查中，MCV+MCH用于篩查效果好。

[關鍵詞]α地中海貧血；β地中海貧血；平均紅細胞體積；平均紅細胞血紅蛋白含量

[中圖分類號] R556.71 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（c）-0159-05

[Abstract]Objective To investigate the genetic heterogeneity of thalassemin of patients in our hospital

and the diagnostic value of mean corpuscular volume（MCV） and mean corpuscular hemoglobin （MCH）in thalassemia screening.Methods From December 2015 to September 2016，1071 patients with thalassemia in our hospital were selected，gap-PCR and polymerase chain reaction-reverse dot blot （PCR-RDB） were used to test α-thalassemia gene and β-thalassemia gene，hematology analyzer was used to test mean corpuscular volume （MCV） and mean corpuscular hemoglobin （MCH） of 904 patients.Results ①Among the 1071 cases，556 cases was male and 515 cases was female，the positive rate of thalassemia was 41.37%（230 cases） for male and 46.21%（238 cases） for female，which was displayed no statistical differences in the two groups （χ2=2.55，P>0.05）.②During different group such as children group （0-16 years old，360 cases），adult group （17-49 years old，651 cases） and senior group （≥ 50 years old，60 cases），the positive rate of thalassemia was 48.33%（174 cases），42.7%（278 cases） and 26.67%（16 cases），respectively，which was displayed statistical differences among the groups （χ2=10.48，P<0.01）.③among 1071specimens，293 cases （27.36%） were diagnosed as α-thalassemia and 157 cases （14.66%） were diagnosed as β-thalassemia.Among the α-thalassemia genotypes，αα/--SEA，-α3.7/αα，αα/-α4.2 were the most common genotypes （93.86%）；among the β-thalassemia genotypes，CD41-42，IVS-Ⅱ-654，-28，CD71-72，CD17 were the most common genotypes （82.81%）；18 cases （1.68%） were diagnosed as α- thalassemia combined with β-thalassemia.④The diagnostic sensitivity of MCV for α-thalassemia，β-thalassemia and αβ-thalassemia screening were 91.18%，99.21% and 92.31%，respectively，and 54.18% for the diagnostic specificity.The diagnostic sensitivity of MCH for α-thalassemia，β-thalassemia and αβ-thalassemia screening were 94.12%，99.21% and 100.00%，respectively，and 51.90% for the diagnostic specificity.The diagnostic sensitivity of MCV+MCH for α-thalassemia，β-thalassemia and αβ-thalassemia screening were 89.08%，99.21% and 84.62%，respectively，and 49.24%% for the diagnostic specificity.There was no significant difference in the sensitivity and specificity between MCV and MCH （χ2=1.77，P>0.05；χ2=0.55，P>0.05）.Conclusion αα/-SEA genotype and βCD41-42 genotype are the most common type in α-thalassemia and β-thalassemia in 1071 patients with thalassemia，it is reasonable to screening the thalassemia by MCV combine with MCH.

[Key words]α-thalassemia；β-thalassemia；Mean corpuscular volume；Mean corpuscular hemoglobin

地中海貧血（簡稱“地貧”）又稱海洋性貧血或珠蛋白合成障礙性貧血，是一種常染色體隱性的單基因遺傳病[1]。由于珠蛋白基因缺陷導致血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈合成減少或不能合成，使得血紅蛋白的組分和含量發生改變，影響到紅細胞的攜氧能力，從而導致不同程度的溶血，使患者發生貧血，其中以α和β地貧較為常見[2]。據WHO估計，世界人口約有4.5%的人群攜帶有地貧基因[3]，在中國主要集中在長江以南的福建、江西、湖南、廣東、廣西、海南、重慶、四川、貴州、云南等省（市、自治區），尤其以兩廣地區最為嚴重。廣東地貧基因攜帶者超過10%，廣西地貧基因攜帶者超過20%，目前世界上還沒有治療地貧的有效方法，所以預防地貧兒的出生尤為重要[4-9]。本研究分析來我院就診的地貧篩查患者的地貧基因類型并分析平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均紅細胞血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）在地貧篩查中的應用價值。

1對象與方法

1.1對象

選擇2015年12月～2016年9月于我院進行地貧基因檢測的患者1071例，以MCV<80 fl和（或）MCH<27 pg者為篩查陽性，對篩查陽性患者再進行地貧基因檢測。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，參與研究者均簽屬知情同意書。其中男性556例，女性515例；按年齡分為兒童組（1～16歲）360例，青壯年組（17～49歲）651例，老年組（≥50歲）60例。

1.2儀器與試劑

血細胞分析儀（LH750）為美國貝克曼庫爾特公司產品，試劑為產家原裝配套試劑。PCR擴增儀（Hema 9600）為貝登生物科技有限公司產品，地貧基因檢測試劑盒由深圳亞能生物技術有限公司提供。

1.3檢測方法

1.3.1血細胞分析 用EDTA抗凝管抽取2 ml靜脈血，直接將樣本在血細胞分析儀上檢測，主要觀察指標為平均紅細胞體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白含量（MCH）。

1.3.2地貧基因分析 用EDTA抗凝管抽取3 ml靜脈血，按照亞能生物公司核酸提取試劑盒說明書提取全血DNA。α地貧基因PCR擴增：取2 μl DNA加入反應管中（反應總體系為25 μl），先96℃加熱5 min，然后98℃ 45 s，65℃ 90 s，72℃ 3 min共10個循環，再98℃ 30 s，65℃ 45 s，72℃ 3 min，共25個循環，最后72℃ 10 min。取PCR產物及示蹤染料各1 μl混勻后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳60 min，電泳結束后，將瓊脂糖凝膠放入紫外透射分析儀上觀察α地貧缺失類型。β地貧基因PCR擴增：取2 μl DNA加入反應管中（反應總體系為25 μl），先50℃加熱15 min，然后95℃加熱10 min，再94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 30 s共35個循環，最后72℃ 10 min，將PCR產物與試劑盒膜條進行雜交，然后洗膜、顯色，肉眼觀察β地貧突變位點類型。

1.3.3各指標的計算方法 真陽性者（TP）：初篩陽性而地貧基因陽性患者；假陽性者（FP）：初篩陽性而地貧基因陰性患者；真陰性者（TN）：初篩陰性而地貧基因陰性患者；假陰性者（FN）：初篩陰性而地貧基因陽性患者；靈敏度=[TP/（TP+FN）]×100%；特異度=[TN/（TN+FP）]×100%；陽性預測值=[TP/（TP+FP）]×100%；陰性預測值=[TN/（TN+FN）]×100%；準確度=[（TP+TN）/（TP+FP+TN+FN）]×100%。由于患者沒有進行血紅蛋白（Hb）電泳分析，而MCV、MCH僅為地貧篩查的初級篩查指標，因此本次的特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度僅針對總的地貧基因篩查進行統計。

1.4統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 1071例地貧患者地貧基因型的分布情況

2.1.1 1071例檢測樣本中按性別和年齡分組的結果分析 1071例檢測樣本中，男性檢出地貧基因230例（41.37%），女性檢出地貧基因238例（46.21%），男、女地貧基因檢測陽性差異無統計學意義（χ2=2.55，P>0.05）；兒童組檢出地貧基因174例（48.33%），青壯年組檢出地貧基因278例（42.7%），老年組檢出地貧基因16例（26.67%），不同年齡組地貧基因檢測陽性差異有統計學意義（χ2=10.48，P<0.01）。

2.1.2 1071例檢測樣本中按地貧基因類型的結果分析 1071例檢測樣本中，確診為α地貧293例（27.36%），包括5種基因亞型，其中以αα/--SEA（174例，59.39%）、-α3.7/αα（72例，24.57%）、αα/-α4.2（29例，9.90%）基因型為主，占總體α地貧的93.86%（表1）；確診為β地貧157例（14.66%），包括15種基因亞型，其中以CD41-42（37.58%）、IVS-Ⅱ-654（22.30%）、-28（10.83%）、CD17（8.92%）、CD71-72（3.18%）基因型為主，占總體β地貧的82.81%（表2）；確診為α地貧復合β地貧基因型18例（1.68%），包括11種復合基因亞型（表3）。

2.2 MCV、MCH在地貧篩查中的價值

本次確診α地貧、β地貧以及α地貧復合β地貧分別為238、127、13例，未檢出地貧基因526例。在三種地貧基因篩查陽性例數中，MCV陽性例數分別為217、126、12例，MCH陽性例數分別為224、126、13例，MCV+MCH陽性例數分別為212、126、11例，MCV、MCH、MCV+MCH三個指標在地貧基因篩查的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度見表4。應用統計學軟件進行分析，MCV與MCH的靈敏度差異無統計學意義（χ2=1.77，P>0.05），特異度差異無統計學意義（χ2=0.55，P>0.05）。

3討論

地貧一旦發病，不僅會給患者自身的身心健康帶來嚴重的危害，也會給社會及患者家庭帶來沉重的精神負擔和經濟負擔[10]。在地貧較為流行的國家和地區，地貧已經成為一個重大的公共衛生問題。在現有的技術條件下，地貧一旦發生尚沒有辦法根治，只能依靠規范的產前篩查和診斷，有效地預防和控制地貧的發生，及時發現可能出生的中重型地貧患兒并終止妊娠[2]。地貧檢測的方法包括血液學進行初篩和基因診斷進行確診[11]。血液學進行初篩，主要是通過血常規指標血紅蛋白含量、MCV、MCH等，結合血清鐵檢測和血紅蛋白電泳分析可初步篩查出地貧患者，基因診斷主要依靠分子生物學手段檢測基因的缺失及突變[12]。

本研究檢測的1071例地貧患者中，檢出地貧基因攜帶者468例，陽性率達到43.70%，反映出本地區是地貧的高發區，應加強本地區地貧的篩查和基因診斷以檢出攜帶者，同時開展人群普查和遺傳咨詢、做好婚前指導以避免地貧基因攜帶者之間聯姻，這對于預防本病有重要意義。本次確診為α地貧患者293例（27.36%），其中以αα/--SEA、-α3.7/αα、αα/-α4.2基因型為主，占總體α地貧的93.86%。其中以αα/--SEA（59.39%）占多數，其基因型與東莞、深圳、廣州地區的基因型相同，與廣東、廣西、湖南、四川、江西等省人群中缺失型α地貧常見基因型相同[13-16]。另外β地貧檢出157例（14.66%），以CD41-42（-TCTT）（37.58%）占多數，其次為IVS-Ⅱ-654（C→T）（22.30%），這與東莞、深圳的β地貧基因型突變類型一致，而重慶、云南地區的β地貧基因型突變類型以CD17（A→T）最多，其次為CD41-42（-TCTT）、IVS-Ⅱ-654（C→T）[17-18]；廣東、廣西β地貧基因型突變類型以CD41-42（-TCTT）最多[4，13]，這表明不同地域和不同人群的β地貧基因突變譜的構成也不盡相同[19]。

本研究還發現，MCV或MCH作為地貧篩查的指標，其靈敏度可達90%以上，但特異性偏低，分別為54.18%、51.90%、49.24%，主要是由于其他一些小細胞低色素性貧血的干擾所致，其中以缺鐵性貧血最為常見，臨床上可以通過測定血清鐵蛋白加以鑒別診斷[1]。此外，本實驗室只檢測3種常見缺失型α-地貧基因（--SEA、-α3.7、-α4.2），對于少見的缺失型α-地貧基因[--THAI，--FIL，--MED，-（α）20.5]以及非缺失型α-地貧基因（αCSα、αQSα及αWSα）沒有檢測，這也是導致初篩特異性偏低的原因之一[20]。也有研究表明[16]，當MCV、MCH均下降，HbA2>4.0%時，應高度懷疑β地貧，因此繼續探討HbA2、MCV+MCH+HbA2聯合方案對臨床的應用價值，值得進一步研究。

綜上所述，對于地貧基因的初篩，不管是一級篩查還是二級篩查，都有漏檢的可能性。在臨床工作中，尤其是優生遺傳咨詢的醫生，對于有地貧家族史且有血液學表型異常但常規基因檢測又未見異常的標本，需告訴檢測者要進一步采用基因測序等技術進一步確診，以提高地貧基因攜帶的檢出率及準確性，減少因漏檢及假陽性給家庭和社會帶來的危害。

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（收稿日期：2017-03-15 本文編輯：任 念）