麥胚多肽-鈣螯合物制備工藝優化及其結構表征

丁媛媛，王 莉，張新霞，王 韌，羅小虎，李亞男，李永富，李 娟，陳正行

麥胚多肽-鈣螯合物制備工藝優化及其結構表征

丁媛媛，王 莉*，張新霞，王 韌，羅小虎，李亞男，李永富，李 娟，陳正行*

（江南大學食品學院，糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

為減少小麥胚芽的資源浪費，提高其附加值，同時解決居民缺鈣的問題，對麥胚多肽與鈣離子螯合的工藝進行研究。以小麥胚芽為原料，以螯合率為考察指標，設計單因素試驗和正交試驗，考察溫度、麥胚多肽與鈣離子物質的量比、時間、pH值對螯合率影響。結果表明，在溫度65 ℃、麥胚多肽與鈣離子物質的量比3∶1、時間60 min、pH 9.5的條件下，螯合率達到最大，為86.21%。對最佳條件下制備的麥胚多肽-鈣螯合物進行結構分析，紅外光譜表明麥胚多肽的氨基和羧基都參與了螯合反應；圓二色譜表明螯合物的二級結構由原來的無序結構向有序、緊密的結構轉變；掃描電子顯微鏡表明螯合物的分子有明顯的聚集現象。

麥胚多肽；螯合鈣；結構表征

小麥胚芽是面粉加工業的副產物，含有豐富的淀粉、蛋白質、不飽和脂肪、維生素以及礦物元素，被營養學家譽為“人類天然的營養寶庫”[1]。其中，碳水化合物含量占45%左右[2]，蛋白質含量占30%左右[3]。麥胚蛋白是一種完全蛋白，含有8 種人體所需的必需氨基酸[4]，尤其富含其他谷物缺乏的賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸[5]。而且，必需氨基酸配比與世界衛生組織/聯合國糧農組織推薦的模式值基本接近[6]，營養價值可與雞蛋蛋白媲美。除此之外，麥胚中還富含生理活性物質，如谷胱甘肽[7]、黃酮類物質[8]、麥胚凝集素[9]、二十八烷醇[10]等。盡管如此，小麥胚芽并沒有得到有效利用，常常被作為下腳料處理，造成資源浪費，環境污染。

目前，小麥胚芽的蘊藏量達到200～300萬 t，有很大的開發空間。相關學者為了節糧減損，對麥胚資源進行深入研究，以期增加其附加值。例如，通過酶解的方式釋放多種生物活性的肽段，其中抗氧化活性肽[11-13]、降血壓活性肽[14]以及金屬螯合活性肽[15-16]都有相關的報道。目前，國內外的學者對鋅螯合肽[17-19]、鐵螯合肽[20-21]研究較多，但是鈣螯合肽的研究主要集中于動物蛋白[22-23]中，由于動物蛋白存在潛在的過敏源，所以迫切需要新的蛋白源，而麥胚蛋白作為來源廣、成本低、質優的植物蛋白，成為鈣螯合肽很有開發前景的原料來源。

市面上的補鈣劑主要有無機鈣、有機鈣和氨基酸鈣[24]：1）無機鈣，如磷酸鈣、碳酸鈣、氯化鈣等，這類補鈣劑溶解性差，吸收率低，對胃有刺激作用；2）有機鈣，如葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、檸檬酸鈣等，這類補鈣劑鈣含量低，總體利用率不高；3）氨基酸鈣，如甘氨酸鈣、谷氨酸鈣等，這類補鈣劑鈣吸收率顯著提高，但易被植酸以及磷酸沉淀。肽鈣作為新型的補鈣劑，如酪蛋白肽鈣，這類補鈣劑中鈣離子與小肽結合，借助小肽的轉運、吸收機制以配合物的形式被小腸吸收，能顯著促進鈣的利用率[25]。因此，以麥胚蛋白源為原料，使鈣離子與麥胚多肽螯合，借助小肽吸收理論，促進鈣離子和多肽的吸收利用具有重要的現實意義。

本研究以小麥胚芽為原料，麥胚分離蛋白經堿性蛋白酶酶解獲得麥胚多肽，向其加入鈣源，制備麥胚多肽-鈣螯合物。通過單因素試驗和正交試驗，確定最佳的螯合條件；利用傅里葉紅外光譜、圓二色譜、掃描電子顯微鏡對多肽及其螯合物進行分析，旨在為補鈣劑的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂小麥胚芽 河南安陽漫天雪食品有限公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g） 廣西南寧龐博生物工程有限公司；HCl、NaOH、CaCl2、無水乙醇、NaCl、茚三酮、鈣紅指示劑（均為分析純） 國藥集團上海化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MP-501A超級恒溫循環槽 上海一恒科學儀器有限公司；COULTER Avanti J-26XP冷凍離心機 美國貝克曼公司；Beta 2-8LDplus CHRIST凍干機 德國Marin Christ公司；FEI Quanta? 200掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；FTIR傅里葉紅外光譜 美國Thermo Electron公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國生物公司。

1.3 方法

1.3.1 麥胚多肽制備

1.3.1.1 麥胚分離蛋白提取及酶解

麥胚分離蛋白提取根據堿溶酸沉[26]的方法，脫脂小麥胚芽粉分散于去離子水中（料液比1∶10（g/mL）），用1 mol/L NaOH溶液將懸濁液調至并穩定在pH 9.5，40 ℃攪拌2 h，5 000 r/min離心10 min，去除沉淀。收集上清液，用1 mol/L HCl溶液調到pH 4.0，靜置60 min，使蛋白絮凝沉淀，5 000 r/min離心10 min，收集蛋白沉淀，沉淀水洗兩次，將蛋白調回pH 7.0。提取的麥胚分離蛋白于冷凍干燥機中冷凍干燥備用。

麥胚分離蛋白用堿性蛋白酶水解，水解條件[26]：蛋白質量分數5%、酶-底物質量比1∶50、溫度50 ℃、pH 8.0，連續水解300 min，水解結束后沸水浴中滅酶10 min，5 000 r/min離心10 min，收集上清液冷凍干燥備用。

1.3.1.2 麥胚分離蛋白酶解多肽水解度和分子質量的測定

水解度的測定根據pH-Stat法[27]，計算如式（1）、（2）所示：

式中：α為α-NH2的平均解離度；B為水解過程中消耗的NaOH的體積/mL；Nb為NaOH濃度/（mol/L）；Mp為參與水解的蛋白質量/g；htot表示每克原料蛋白質的總肽鍵數，8.3 mmol/g。

多肽分子質量分布的測定：在Agilent 1100高效液相色譜系統上采用凝膠過濾色譜柱TSK G2000 SWXL（7.8 mm×300 nm）測定。測定條件：流動相為V（乙腈）∶V（水）=3∶7，流速0.5 mL/min，紫外檢測波長220 nm。標準蛋白：GGG（189 D）、GGYR（451 D）、桿菌肽（1 450 D）、抑肽酶（6 500 D）、細胞色素C（12.5 kD）。

1.3.2 麥胚多肽與鈣離子的螯合工藝流程

麥胚多肽→調節螯合條件（溫度、pH值、麥胚多肽與鈣離子物質的量比、時間）→螯合→3 倍冷無水乙醇沉淀螯合物→10 000×g離心15 min，收集沉淀→用無水乙醇洗滌至上清液加入鈣指示劑不變色，加入茚三酮指示劑加熱后不變紫[28]→測定螯合物中鈣的含量。

鈣含量的測定采用原子吸收分光光度法[29]，螯合率計算如式（3）所示：

1.3.3 單因素試驗

將麥胚多肽溶于20 mmol/L的Tris-HCl溶液中，配制成不同濃度的多肽溶液，添加一定量的50 mmol/L的CaCl2溶液，恒溫水浴一定時間。溶液分別以多肽與鈣離子物質的量比（0.3∶1、2∶1、3∶1、6∶1、9∶1、12∶1）、反應液pH值（3、4、5、6、7、8、9、10）、溫度（10、20、30、40、50、60、70 ℃）、時間（10、30、60、90、120 min）為影響因素，以螯合率為指標，考察各因素對螯合反應的影響。反應基本條件為：pH 7.8、溫度40 ℃、時間60 min、多肽與鈣離子物質的量比3∶1。

1.3.4 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取合適的因素水平，以鈣螯合率為指標，設計四因素三水平正交試驗。

表 1 正交試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array experiments

1.3.5 麥胚多肽-鈣螯合物的表征

1.3.5.1 傅里葉紅外光譜分析

在最佳螯合條件下，制備麥胚多肽-鈣螯合物，取適量麥胚多肽和螯合物分別與光譜純級KBr混合并研磨，壓制成透明薄片，在4 000～400 cm－1波段內對樣品進行掃描，分辨率0.1 cm－1，分析特征峰。

1.3.5.2 圓二色譜分析

將在最佳條件下制備的螯合物以及麥胚多肽分別溶解于去離子水中，多肽和螯合物的溶液在遠紫外區域（190～250 nm）進行觀察。二級結構（包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲）由圓二色譜程序軟件分析。

1.3.5.3 掃描電子顯微鏡觀察

在最佳螯合條件下，制備麥胚多肽-鈣螯合物，取適量麥胚多肽和螯合物分別均勻涂抹于樣盤，噴金鍍膜處理，處理好的樣品放入掃描電子顯微鏡觀察。

1.4 數據處理

實驗結果利用SPSS進行數據處理與分析，Origin 8.5進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 水解度、螯合率及多肽分子質量變化

圖 1 水解度和螯合率隨水解時間的變化Fig. 1 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis and metal chelating activity

由圖1可知，在整個水解過程中，隨著水解時間的延長，水解度不斷增大，在300 min時水解度達到最大值（15.35±0.19）%。前60 min是水解快速反應的階段，在此階段內肽鍵大量斷裂，水解度快速升高，之后由于可水解的催化位點變少，水解速度放緩。另一方面，隨著水解時間的延長，螯合率先增加后減少，在240 min時達到最大值（48.26±0.53）%，此時水解度為（14.70±0.27）%。這說明在堿性蛋白酶的作用下，麥胚分離蛋白隨著水解時間的延長釋放出越來越多的多肽片段，這些多肽由于暴露出更多的螯合位點所以比大分子的蛋白更有利于螯合。但是，過度水解形成的游離氨基酸并不利于螯合[30]。為了進一步驗證該結論，對不同水解時間的多肽組分進行分子質量的分析。

表 2 不同水解時間酶解液中多肽分子質量分布Table 2 Molecular weight distribution of wheat germ polypeptides at different hydrolysis times

分別對水解60～300 min的麥胚多肽的分子質量分布進行測定（表2）。水解240 min時，螯合率最高，此時的多肽混合物的組成成分與水解60、120、180 min相比較，大分子的多肽（大于1 000 D）較少，小分子的多肽（小于1000 D）較多，說明大分子的多肽并不利于螯合；然而水解300 min時鈣螯合率下降，與240 min相比，300 min的組成成分中小肽或氨基酸（小于500 D）所占比例提高，說明過度水解形成的小分子也不利于螯合。總之，要達到較好的螯合效果，要求水解形成的多肽分子質量不能太大或太小，本研究中選擇240 min作為制備多肽的最佳水解時間，該結論與相關的研究[15]一致。

2.2 單因素試驗結果

圖 2 麥胚多肽與鈣離子物質的量比對螯合率的影響Fig. 2 Effect of ratio of wheat germ polypeptide to Ca2+on chelation efficiency

2.2.1 麥胚多肽與鈣離子物質的量比對螯合率的影響從圖2可以分析出，當麥胚多肽與鈣離子物質的量比為0.3∶1時，螯合率較低，說明此時的鈣離子過量，大量的鈣離子未參與螯合；提高二者比值，螯合率成直線上升，當麥胚多肽與鈣離子物質的量比超過2∶1后，螯合率增速減緩，說明此時多肽的添加量已經接近飽和，繼續添加多肽對螯合率影響不大，但多肽的有效利用率下降。最終確定多肽與鈣離子物質的量比范圍2∶1～6∶1。這與氨基酸-金屬離子螯合物略有差別，可能由于麥胚分離蛋白水解物的組成成分復雜，既有氨基酸，又有分子質量不同大小的多肽，所以，發生螯合反應時不像氨基酸反應那樣單一，不是嚴格的按照2∶1的比例。

2.2.2 pH值對螯合率的影響

圖 3 pH值對螯合率的影響Fig. 3 Effect of pH on chelation efficiency

由圖3可知，pH值對于螯合率有較大影響，在pH 3～10的范圍內，螯合率先下降后上升，在強堿性條件下又下降。可能的原因是在強酸性條件下，多肽分子完全展開，暴露出供電基團（如—C＝O、—NH2），這些供電基團有一定的吸引鈣離子的能力。在弱酸環境，H+結合在多肽分子表面，使某些基團帶上正電，從而對鈣離子形成排斥作用，不利于螯合物的形成[28]。在弱堿性條件下，—COOH電離失去H+帶負電，—NH2也能吸引帶正電的離子，這些都也有利于螯合反應的進行，使螯合率升高[31]。在強堿性條件下，OH－與多肽中的供電子基團爭奪鈣離子，生成了氫氧化鈣沉淀，螯合率降低。適宜的反應pH值范圍是8～10。

2.2.3 溫度對螯合率的影響

圖 4 溫度對螯合率的影響Fig. 4 Effect of temperature on chelation efficiency

從圖4可知，隨溫度的升高，螯合率先增加后減少，在60 ℃附近達到最大值。這是因為適當提高反應溫度有利于增加多肽與鈣離子碰撞的次數，使螯合反應順利進行。但是，溫度過高，多肽易發生羰氨反應[31]，減少了鈣離子的螯合位點，而且氨基酸或小肽與金屬離子的螯合為放熱反應[32]，過高的溫度不利于螯合。適宜的溫度范圍是50～70 ℃。

2.2.4 時間對螯合率的影響

圖 5 時間對螯合率的影響Fig. 5 Effect of reaction time on chelation efficiency

從圖5可以看出，螯合率隨反應時間的延長先增加后基本維持不變。在30 min時，螯合率已經達到較高的值，30 min之后螯合率上升緩慢，說明螯合反應是快速的反應。適宜的時間范圍是30～90 min。

2.3 正交試驗結果

表3顯示，各因素對螯合率的主次影響順序為：pH值＞溫度＞麥胚多肽與鈣離子物質的量比＞時間；優化后的最優組合為A3B3C2D2，即pH 9.5、溫度65 ℃、多肽與鈣離子物質的量比3∶1、時間60 min。對優化得到的最佳的螯合條件進行驗證，在此條件下鈣螯合率為86.21%。

表 3 麥胚多肽與鈣離子螯合的正交試驗Table 3 Orthogonal array design with experimental values of chelation efficiency

2.4 麥胚多肽-鈣螯合物的表征

2.4.1 麥胚多肽及其螯合物的紅外光譜分析

3 399.88 cm－1主要由N—H的伸縮振動所致；1 652.63 cm－1屬于酰胺Ⅰ帶，主要由C＝O的伸縮振動引起；1 400.08 cm－1屬于氨基酸殘基側鏈基團—COO－的吸收峰。由圖6可以看出，特征區—NH2的N—H吸收峰由3 399.88 cm－1移動到3 419.51 cm－1；酰胺Ⅰ帶C＝O吸收峰由1 652.63 cm－1移動到1 648.40 cm－1；—COO－吸收峰由1 400.08 cm－1移動到1 409.75 cm－1，麥胚多肽-鈣螯合物的紅外光譜發生了明顯的變化，說明多肽中氨基和羧基均參與了鈣的螯合反應[33]。

圖 6 麥胚多肽（A）及其螯合物（B）的紅外光譜Fig. 6 Infrared spectra of wheat germ polypeptides (A) and calciumchelating wheat germ polypeptides (B)

2.4.2 麥胚多肽及其螯合物的二級結構分析

蛋白質多肽鏈之間可形成α-螺旋、β-折疊、β-轉角及無規則卷曲等立體結構，外界條件可引起這些二級結構的改變。麥胚多肽及其螯合物的二級結構用圓二色譜儀進行分析（圖7和表4）。麥胚多肽的二級結構主要以無規則卷曲（97.8%）為主，以無序的形式存在；而螯合物的二級結構α-螺旋、β-折疊、β-轉角所占的比例明顯上升，無規則卷曲所占的比例明顯降低。說明螯合反應改變了麥胚多肽原有的二級結構，由原來的無序結構（柔性結構）向更加有序、規則、緊密的結構（剛性結構）轉變。

圖 7 麥胚多肽及其螯合物的圓二色譜Fig. 7 Far-UV circular dichroism spectra of wheat germ polypeptides and calcium-chelating wheat germ polypeptides

表 4 麥胚多肽及其螯合物的二級結構Table 4 Secondary structure contents of wheat germ polypeptides and calcium-chelating wheat germ polypeptides

2.4.3 掃描電子顯微鏡分析

圖 8 麥胚多肽（A）及螯合物（B）的掃描電子顯微鏡圖Fig. 8 Scanning electron micrographs of wheat germ polypeptides (A) and calcium-chelating wheat germ polypeptides (B)

多肽的微觀結構反映其分子的聚集情況，由圖8可見，麥胚多肽呈疏松多孔的小顆粒狀，而螯合物呈大的不均勻的團狀結構，這表明螯合反應能破壞多肽的結構，使之發生聚集。這種聚集主要由于鈣離子與多肽分子的羧基氧原子和氨基氮原子發生作用產生的（圖9），多肽之間通過鈣離子連接發生交聯，形成較大的顆粒，而且這些顆粒之間相互吸引進而發生聚集。

圖 9 麥胚多肽與鈣離子結合機理推測圖Fig. 9 Predicted mechanism of complexation of wheat germ polypeptides with calcium ion

3 結 論

本實驗以小麥胚芽為原料，利用堿性蛋白酶水解麥胚分離蛋白產生麥胚多肽，將多肽與鈣離子進行螯合。通過單因素試驗和正交試驗優化出最佳的螯合條件為pH 9.5、溫度65 ℃、麥胚多肽與鈣離子物質的量比3∶1、時間60 min，此條件下的螯合率為86.21%。該螯合率較豬皮膠原多肽螯合鈣[34]、白鰱魚骨膠原多肽螯合鈣[31]等要高，對提高鈣的利用率有重要意義。對螯合物的結構進行分析，紅外光譜說明麥胚多肽的氨基和羧基都參與了螯合反應；圓二色譜表明螯合物的二級結構與原來的多肽相比由無序結構（柔性結構）向有序、緊密的結構轉變（剛性結構）；掃描電子顯微鏡則說明螯合物較原來多肽分子有聚集現象。總之，本研究對提高小麥胚芽的附加值，具有重要的經濟和理論意義。

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Optimized Preparation and Structural Characterization of Calcium-Chelating Polypeptides from Wheat Germ Protein Hydrolysate

DING Yuanyuan, WANG Li*, ZHANG Xinxia, WANG Ren, LUO Xiaohu, LI Yanan, LI Yongfu, LI Juan, CHEN Zhengxing*
(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

This study aimed to reduce the waste of wheat germ resource and simultaneously achieve its value-added utilization for the purpose of solving the problem of calcium deficiency in some populations. Wheat germ protein hydrolysates was prepared by enzymatic hydrolysis using alkaline protease and then chelated with calcium ions to obtain calcium-chelating polypeptides. One-factor-at-a-time and orthogonal array experiments were devised to investigate the in uence of reaction temperature, molar ratio between polypeptides and calcium ions, reaction time and pH on the chelation efficiency. The optimal conditions that provided maximum chelation efficiency (86.21%) were determined as follows: reaction at 65 ℃ and pH 9.5 for 60 min with a molar ratio of polypeptide to calcium of 3:1. Infrared spectroscopic analysis con rmed the coordination reaction between calcium and carboxyl/amino groups in the polypeptides. Circular dichroism spectra indicated that the calcium-chelating polypeptides lost their disordered secondary structure and formed compact and ordered conformations compared to the control group. Scanning electron microscopy observation con rmed significant aggregation of calcium-chelating polypeptides.

wheat germ polypeptides; chelated calcium; structural characterization

10.7506/spkx1002-6630-201710036

TS201.2

A

1002-6630（2017）10-0215-07引文格式：

丁媛媛, 王莉, 張新霞, 等. 麥胚多肽-鈣螯合物制備工藝優化及其結構表征[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 215-221.

10.7506/spkx1002-6630-20171036. http://www.spkx.net.cn

DING Yuanyuan, WANG Li, ZHANG Xinxia, et al. Optimized preparation and structural characterization of calciumchelating polypeptides from wheat germ protein hydrolysate[J]. Food Science, 2017, 38(10): 215-221. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710036. http://www.spkx.net.cn

2016-08-08

國家自然科學基金面上項目（31471616）；江蘇省研究生培養創新工程項目（SJZZ15-0143）；全國糧食行業青年拔尖人才服務行業需求自主選題項目（LQ2016301）

丁媛媛（1991—），女，碩士研究生，研究方向為糧食精深加工。E-mail：1048327395@qq.com

*通信作者：王莉（1981—），女，副教授，博士，研究方向為糧食精深加工。E-mail：legend0318@hotmail.com陳正行（1960—），男，教授，博士，研究方向為糧食精深加工。E-mail：zxchen2007@126.com