巴氏滅菌與超高溫滅菌對全脂牛乳揮發性風味物質的影響

張曉梅，仝令君，潘明慧，艾娜絲，王 靜,*，孫寶國

巴氏滅菌與超高溫滅菌對全脂牛乳揮發性風味物質的影響

張曉梅1，仝令君2，潘明慧2，艾娜絲2，王 靜2,*，孫寶國2

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.北京工商大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048）

采用頂空固相微萃取分別對原料全脂牛乳、巴氏滅菌全脂牛乳和超高溫滅菌全脂牛乳的揮發性成分進行萃取，經氣相色譜-質譜聯用儀分析。結果顯示，原料全脂牛乳中共鑒定出12 種揮發性物質，主要包括酸類和烷烴類；巴氏滅菌全脂牛乳中共鑒定出17 種揮發性物質，主要包括酸類、酯類、酮類和烷烴類；超高溫滅菌全脂牛乳中共鑒定出17 種揮發性物質，主要包括酸類、酮類和烷烴類。經數據統計分析，3 種牛乳樣品的揮發性組分呈現明顯差異。

牛乳的營養成分全面均衡，結構合理，易于人體吸收，是日常膳食的理想健康選擇之一[1]。原料牛乳經采集、運輸及貯存后，在生產加工前，對原料乳的有效滅菌是必不可少的工序步驟[2]。目前，巴氏殺菌（72～75 ℃，15～16 s或80～85 ℃，10～15 s）和超高溫滅菌（135～150 ℃，4～15 s）是國內外普遍采用的牛乳滅菌方式[3]。通過巴氏滅菌和超高溫滅菌可以達到滅活微生物和提高產品貨架期的作用[4]。另有文獻[5-8]指出，原料乳中的蛋白、脂類、糖類和無機鹽等物質成分也會因此發生變化，這不僅會對牛乳的功能性狀產生一定的作用，也會使牛乳的揮發性風味發生一些變化[9]。

目前比較常見的揮發性風味物質分析的前處理方法主要有同時蒸餾萃取法、溶劑輔助蒸發萃取法和固相微萃取法[10]。其中，同時蒸餾萃取法需要高溫溶劑萃取，溶劑輔助蒸發萃取法需要接近真空溶劑萃取，經實驗結果分析，這2 種萃取方法都會一定程度上使牛乳的揮發性物質產生變化和損失[11]。固相微萃取法在溫和條件下，將萃取與濃縮同時進行，靈敏度高，操作流程簡便[12]，對于揮發性物質種類較多但含量較低且易發生變化的牛乳制品來說，是比較有效可行的一種前處理方法。

本實驗以原料全脂牛乳、巴氏滅菌全脂牛乳和超高溫滅菌全脂牛乳為研究對象，選擇頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid-phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯用為研究方法，對3 種牛乳制品的揮發性風味物質進行檢測，旨在分析巴氏滅菌和超高溫滅菌對原料牛乳中揮發性風味物質的影響情況，為熱處理條件下牛乳的揮發性風味變化規律研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料全脂牛乳、巴氏滅菌全脂牛乳（滅菌條件85 ℃，15 s）、超高溫滅菌全脂牛乳（滅菌條件137～141 ℃，4 s） 北京三元食品股份有限公司；所有牛乳樣品均隨機采自同一農場同一批次樣品，置于手提冷藏盒中2 h內運回實驗室并4 ℃保存，2 d內完成實驗分析。

C7～C30正構烷烴標準品（色譜純） 美國Supelco公司；2-甲基-3-庚酮（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；氯化鈉（分析純） 北京國藥集團化學試劑有限公司；氦氣（純度99.999%） 北京氦普北分氣體工業有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C GC-MS聯用儀、HP-5ms毛細管柱色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；手動HS-SPME進樣器、固定搭載裝置、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/ polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）、75 μm CAR/ PDMS、85 μm PA、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB萃取纖維 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME萃取3 種牛乳揮發性風味成分

取10 mL牛乳樣品、2 g氯化鈉與1 μL質量濃度為0.816 μg/μL的內標物2-甲基-3-庚酮溶液，置于20 mL裝有磁力攪拌子的頂空樣品瓶中，40 ℃恒溫水浴中加熱平衡30 min，將手動HS-SPME進樣器固定在SPME搭載裝置上，并將萃取針頭插入頂空瓶中，推出萃取纖維至瓶內牛乳液面約5 mm距離處，頂空吸附30 min。吸附結束后，快速插入GC-MS進樣口解吸5 min。

1.3.2 GC-MS分析條件

G C條件：H P-5 m s毛細管色譜柱（3 0 m× 0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度30 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至300 ℃，不保持；載氣為氦氣；流速1.0 mL/min；不分流進樣。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍50～380 u；掃描方式為全掃描；溶劑延遲5 min。

1.3.3 定性定量分析

1.3.3.1 定性分析

對不同牛乳樣品揮發性物質的定性分析主要采用GC-MS聯用儀MSDChem工作站NIST 11譜庫，選擇正反匹配度大于600/600的物質，另外結合校對保留指數（retention index，RI）、標準品定性等方法進行確定。按公式（1）計算RI：

式中：n和n+1為未知物流出前、后正構烷烴碳原子數；tn+1和tn為正構烷烴的保留時間/min；tr為未知物的保留時間/min（tn＜tr＜tn+1）。

1.3.3.2 定量分析

以2-甲基-3-庚酮為內標，默認每個化合物對2-甲基-3-庚酮的相對相應因子為1。根據內標物的質量濃度、樣品中各組分的峰面積與內標物的峰面積，計算牛乳樣品中各組分的含量，按公式（2）計算：

式中：mi為未知物的含量/（μg/L）；m0為內標物的質量濃度/（μg/μL）；Ai為未知物的峰面積；A0為內標物的峰面積；Vi為萃取時所加乳樣體積/L；V0為所加內標物溶液體積/μL。

1.4 數據處理

本研究通過Excel 2016軟件進行實驗數據的匯總處理，SPSS 22.0軟件進行3 種牛乳揮發性風味物質的顯著性分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 HS-SPME萃取纖維的選擇

不同的萃取纖維對同一萃取對象可能具有不同的萃取選擇性，相同的萃取纖維在不同的色譜柱中也可能有不同的解吸表現[13-14]。因此，針對牛乳的揮發性物質種類較多、含量較低的特點，本研究選擇具有較普遍適用性、極性范圍較廣的HP-5ms色譜柱進行牛乳樣品的GC-MS定性定量分析。同時，在萃取纖維的優化選擇中，考慮到原料全脂牛乳經乳腺采集后未經滅菌等工序，由熱處理產生的揮發性風味物質可能較少；另外，超高溫滅菌全脂牛乳的滅菌溫度較高，可能會對牛乳的揮發性風味物質產生比較明顯的熱敏性變化。而巴氏滅菌全脂牛乳的滅菌條件溫和，在殺菌的同時比較完全的保留了牛乳的揮發性風味物質。因此，本研究選擇巴氏滅菌全脂牛乳作為實驗對象，對目前比較常用的5 種萃取纖維（75 μm CAR/PDMS、85 μm PA、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS）進行優化選擇，如圖1所示。

圖 1 萃取纖維對巴氏全脂牛乳揮發性成分萃取效果的影響Fig. 1 Effects of different SPME fibers on the extraction efficiency of volatile compounds from whole milk

由圖1可知，5 種萃取纖維對巴氏全脂牛乳的揮發性成分的萃取在種類和含量上都表現出來不同的選擇性。其中，100 μm PDMS纖維和75 μm CAR/PDMS纖維萃取到的揮發性物質種類和含量都少于其他萃取纖維。50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取到的揮發性風味物質種類較多，但是其萃取的物質含量較少。同時，85 μm PA纖維萃取到的揮發性風味物質含量較多，但是其萃取到的物質種類較少。65 μm PDMS/DVB纖維萃取到的揮發性物質的種類和含量均顯著（P＜0.05）多于其他萃取纖維，由此認為當選擇HP-5ms色譜柱來進行牛乳樣品揮發性風味物質的HS-SPME-GC-MS分析時，65 μm PDMS/DVB纖維是比較理想的萃取纖維。因此，本研究選擇65 μm PDMS/DVB纖維來萃取分析牛乳樣品中的揮發性風味組分。

2.2 HS-SPME-GC-MS分析

由表1可知，均有效萃取檢出了揮發性風味物質，主要包括酸類、酮類、醛類、酯類和烷烴類。其中，酸類物質可能是在牛乳中內源酶或物理條件的作用下，乳脂肪中的甘油三酯發生水解反應而產生。脂肪酸的風味閾值較低，而且在牛乳中較易產生，是牛乳中很常見且具有代表性的一類揮發性風味物質，尤其是己酸、辛酸等短碳鏈脂肪酸，都是牛乳中典型的揮發性組分[15]。酮類物質主要是飽和脂肪酸β氧化系列反應的合成產物，其中甲基酮類對牛乳風味也有重要的影響，比如2-庚酮、2-壬酮等具有奶香、甜香風味，也是牛乳風味的代表性組分[16-17]。醛類物質可能是乳脂肪氧化的二級或三級氧化產物，由于其風味閾值較低，風味特征較明顯，醛類物質也是牛乳揮發性物質的重要組分[18-19]。酯類物質可能來自于游離脂肪酸和短鏈脂肪醇的酯化反應，酯類物質對于牛乳風味也有一定的影響[20-21]。烷烴類物質是一類來源較為復雜且出現頻率并不穩定的牛乳揮發性物質，它可能來源于在乳牛乳腺等機體組織或者牛乳中游離脂肪酸的自動氧化，也可能來自于飼料經過瘤胃遷移至牛乳中。烷烴類物質的風味閾值較高，風味特征并不明顯，并且在其他種類揮發性組分風味強度較明顯的前提下，烷烴類物質在現有濃度水平上對牛乳揮發性風味影響有限[22]。

表 1 HS-SPME-GC-MS分析牛乳樣品揮發性風味物質成分結果Table 1 HS-SPME-GC-MS analytical results for the volatile components of the milk samples

由圖2和表1可知，從巴氏滅菌到超高溫滅菌，隨著殺菌溫度的增高，巴氏滅菌全脂牛乳和超高溫滅菌全脂牛乳的揮發性物質含量相比原料全脂牛乳均呈增加趨勢，這與相關熱處理牛乳風味研究結果基本一致[23-24]。在原料全脂牛乳中，由于原料乳從乳牛乳腺中分泌收集而來，并未受到較多的工藝因素影響，所以揮發性物質含量較少，組成也較為單一，只有酸類、烷烴類和少量的醛類。其中酸類和醛類可能來自于牛乳在乳腺合成分泌過程中發生的一些生化反應，烷烴類可能來自于飼料中相關物質的遷移與保留[25]。

圖 2 3 種牛乳樣品揮發性成分含量對比Fig. 2 Comparison of contents of volatile components from the milk samples

巴氏滅菌全脂牛乳和原料全脂牛乳相對比，巴氏滅菌全脂牛乳中出現了酯類物質和酮類物質，酸類物質、烷烴類和醛類物質也有不同程度的增加。這是由于在巴氏滅菌的熱處理作用下，牛乳中各組分的相互作用增強，比如乳脂肪的氧化反應促進了牛乳中脂肪酸的釋放，使酸類物質含量增加，并且促進了游離脂肪酸與醇類物質的酯化使酯類物質生成，而乳脂肪的β氧化使酮類物質等二級、三級氧化產物產生[26-27]。

超高溫滅菌全脂牛乳和巴氏滅菌全脂牛乳相對比，由于殺菌溫度的進一步提高，超高溫滅菌全脂牛乳的揮發性物質含量也隨之增加，其中酮類和烷烴類物質含量增加明顯，醛類物質含量無明顯變化，酸類物質含量有所減少，酯類物質未被檢測到。由于超高溫殺菌溫度較高，可能更促進乳脂肪等的氧化反應進一步發生，進而生成更多的二級、三級氧化產物，比如酮類和烷烴類等物質[28-29]。同時，更高溫度的加熱作用可能使酯類物質的穩定性降低，發生降解轉化，并且被氧化成了其他更穩定的揮發性物質。而酸類物質的減少可能是其更多的參與到比如氧化等類型的轉化反應中，使游離脂肪酸的含量降低[30]。

2.3 PCA和聚類分析結果

圖 3 3 種牛乳樣品揮發性成分含量（A）和種類（B）的PCA圖Fig. 3 Principal component analysis of amounts (A) and types (B) of volatile components from the milk samples

從圖3A可以看出，PC1貢獻率為77.318%，PC2貢獻率為19.215%，PC3貢獻率為3.467%。3 種牛乳樣品的揮發性成分在PC1和PC2區分明顯，而PC1和PC2的整體貢獻率超過90%，這說明由于滅菌條件的不同，3 種牛乳的揮發性風味成分發生了顯著的變化。如圖3B所示，PC1貢獻率為62.001%，PC2貢獻率為37.999%，二者整體貢獻率超過90%，說明該PCA能夠準確反映出揮發性風味物質的種類對區分3 種牛乳樣品揮發性風味差異的顯著作用。其中，從PC1可知，酯類和酸類在顯示3 種牛乳揮發性風味物質的差異性上更為明顯，醛類次之，之后為酮類和烷烴類；從PC2可知，酮類和烷烴類在區分3 種牛乳揮發性風味物質的作用上更為突出，醛類次之，之后為酸類和酯類。

圖 4 3 種牛乳樣品揮發性成分聚類分析Fig. 4 Cluster analysis of volatile components from the milk samples

3 種牛乳的揮發性物質按照各種類含量的聚類分析中，本研究初步探討了區分揮發性風味物質差異的相似性和相異性。由圖4可知，在5 類揮發性物質（酸類、酯類、酮類、烷烴類和醛類）中，共有3 組物質對3 種牛乳的揮發性物質起到了差異性的區分作用。其中酮類和醛類在顯示3 種牛乳揮發性風味物質的差異性中起到了一種相似的區分作用，酸類和烷烴類起到了另一種相似的區分作用，而酯類則起到了第3種顯示牛乳樣品揮發性物質差異的區分作用。

3 結 論

本研究選擇65 μm PDMS/DVB萃取纖維，采用HSSPME-GC-MS方法對原料全脂牛乳、巴氏滅菌全脂牛乳和超高溫滅菌全脂牛乳的揮發性風味物質進行了萃取和分析。其中原料全脂牛乳中共鑒定出12 種揮發性物質，主要為酸類和烷烴類，包括己酸、辛酸、正癸酸、十四烷和十五烷等；巴氏滅菌全脂牛乳中共鑒定出17 種揮發性物質，主要為酸類、酯類、酮類和烷烴類，包括己酸、辛酸、丙酸丁酯、丁酸丁酯、2-壬酮、十四烷和十六烷等；超高溫滅菌全脂牛乳中鑒定出17 種揮發性物質，主要為酸類、酮類和烷烴類，包括己酸、辛酸、2-庚酮、2-壬酮、十五烷和十七烷等。隨著殺菌溫度的提高，牛乳中產生的揮發性物質在含量上呈穩定增加趨勢，但是在種類上并沒有呈現明顯的穩定增加趨勢。經過對3 種牛乳制品中揮發性物質的PCA和聚類分析可知，3 種牛乳的揮發性風味物質差異明顯，酸類、酯類、酮類、醛類和烷烴類這5類揮發性風味物質在顯示3 種牛乳的揮發性物質差異性分析中分別起到了不同的區分作用。

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Effect of Pasteurization Versus Ultra-High-Temperature on Volatile Flavor Compounds of Bovine Whole Milk

ZHANG Xiaomei1, TONG Lingjun2, PAN Minghui2, AI Nasi2, WANG Jing2,*, SUN Baoguo2
(1. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The volatile flavor compounds of raw whole milk (RWM), pasteurized whole milk (PWM) and ultra-hightemperature whole milk (UWM) were extracted by headspace solid-phase micro-extraction, and then analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS). A total of 12 volatiles were identified from RWM, mainly including acids and hydrocarbons; 17 volatiles were identified from PWM, mainly including acids, esters, ketones and hydrocarbons; and 17 volatiles were identified from UWM, mainly including acids, ketones and hydrocarbons. According to the statistical analysis of the data, there was a significant variability among the volatiles of 3 milk samples.

raw whole milk; pasteurized whole milk; ultra-high-temperature (UHT) whole milk; volatile flavor compound

10.7506/spkx1002-6630-201710029

TS252

A

1002-6630（2017）10-0173-05

張曉梅, 仝令君, 潘明慧, 等. 巴氏滅菌與超高溫滅菌對全脂牛乳揮發性風味物質的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 173-177. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710029. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Xiaomei, TONG Lingjun, PAN Minghui, et al. Effect of pasteurization versus ultra-high-temperature on volatile flavor compounds of bovine whole milk[J]. Food Science, 2017, 38(10): 173-177. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710029.http://www.spkx.net.cn

2016-08-20

國家自然科學基金面上項目（31571940）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31501559）

張曉梅（1987—），女，博士研究生，研究方向為乳品風味。E-mail：zxmwaiting@163.com

*通信作者：王靜（1976—），女，教授，博士，研究方向為功能性食品配料。E-mail：wangjing@th.btbu.edu.cn

原料全脂牛乳；巴氏滅菌全脂牛乳；超高溫滅菌全脂牛乳；揮發性風味物質