基于2 種衍生化方法對牛乳中寡糖的高效液相色譜-質譜聯用分析

陳新新，蘆 晶，劉 鷺，逄曉陽，張書文，李 誠，呂加平

基于2 種衍生化方法對牛乳中寡糖的高效液相色譜-質譜聯用分析

陳新新1,2，蘆 晶2，劉 鷺2，逄曉陽2，張書文2，李 誠1,*，呂加平2

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

利用Sep-Pak C18柱和石墨化碳柱對已脫脂和除去蛋白質的牛乳進行分離純化，并采用1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）和2-氨基吖啶酮（2-aminoacridone，AMAC），2 種衍生化試劑對其進行衍生化處理，通過高效液相色譜進行優化，AMAC衍生化的結果（約有67 個峰）明顯優于PMP衍生化的結果（約20 個峰），最終確定AMAC為最佳衍生化試劑，并利用最終優化好的高效液相色譜條件，采用高效液相色譜-串聯離子阱飛行時間質譜對牛乳中寡糖進行測定，最終測得7 種乳寡糖并獲得該7 種乳寡糖的單糖組成。

牛乳寡糖；1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮；2-氨基吖啶酮；高效液相色譜-串聯離子阱飛行時間質譜

牛乳中含有4.5%的碳水化合物，其中乳糖的含量超過80%，寡糖含量約占總糖含量的4%。研究發現游離寡糖是哺乳動物乳汁中除乳糖和脂肪外種類最為豐富的固形化合物[1]。乳寡糖是由3～10個單糖通過糖苷鍵共價連接的碳水化合物聚糖，構成牛乳寡糖的單糖包括葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、N-乙酰葡糖胺（N-acetylglusamine，GlcNAc）、巖藻糖（fucose，Fuc）、N-乙酰神經氨酸（N-acetylneuraminic acid，NeuAc）和N-羥乙酰神經氨酸（N-glycolylneuraminic acid，NeuGc），大多數的牛乳寡糖都有一個乳糖核心（Gal（β1-4）Glc）[2-3]。乳制品特別是嬰兒配方奶粉、食品工業及功能食品制造商確定為牛奶中的低聚糖是一種新穎、有高潛力的生物活性食品配料。研究發現，乳寡糖作為益生元可以刺激腸道有益細菌的生長如新生兒腸道內雙歧桿菌，改善微生態，從而降低嬰幼兒患病風險，如腹瀉，腦膜炎和中耳炎等[4-8]。鑒于乳寡糖特定的生理功能，人們開始關注乳寡糖的研究。由于牛乳寡糖種類繁多且結構復雜，目前對牛乳寡糖結構的解析較少，且國內對牛乳寡糖的測定方法鮮有報道。高效液相色譜、生物質譜以及液相色譜-質譜聯用技術是目前分析寡糖的有效的工具[9-11]。

寡糖衍生化可有效改善寡糖光學吸收及質譜檢測的離子化效率，提高其分析的靈敏度[12-14]。本實驗對分析牛乳寡糖的衍生化試劑及高效液相色譜分析條件進行優化，通過最佳衍生化試劑2-氨基吖啶酮的柱前衍生化法進行高效液相色譜-串聯離子阱飛行時間質譜分析，以期建立牛乳寡糖結構解析及含量測定的可行方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳采自北京市某牛場初次泌乳且泌乳4 個月的荷斯坦牛；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Fisher公司；二甲基亞砜（色譜純） 美國Corning公司；硼氰化鈉（色譜純） 美國阿拉丁公司；冰醋酸、無水乙醇、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）等其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Xbridge氨基色譜柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）、Sep-Pak C18柱（500 mg/4 mL） 美國Waters公司；石墨碳柱（150 mg/4 mL） 美國Grace公司；MVS-1渦旋混合器 北京金北德工貿有限公司；3K15離心機 美國Sigma公司；ZLS-4真空旋轉蒸發儀 湖南赫西儀器裝備有限公司；20AD高效液相色譜-串聯離子阱飛行時間質譜儀日本島津公司；ULUP-IV-10T超純水裝置 西安優普儀器設備有限公司；PHS-3C型pH計 成都世紀方舟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳寡糖的提取

取10 mL牛乳，于10 ℃、105×g超高速離心90 min，除去底部的酪蛋白和上層的脂肪，取5 mL中間水層加入10 mL無水乙醇，4 ℃放置2 h，于4 ℃、1 503×g離心30 min（重復2 遍）后取上清液，然后用濃縮儀濃縮干燥，即為牛乳寡糖粗品[4]。

1.3.2 牛乳寡糖的純化及富集

分別采用Sep-Pak C18柱和石墨化柱對濃縮后的液體進行分離純化，具體操作：用5 mL甲醇平衡Sep-Pak C18柱，然后用10 mL 0.1% TFA溶液洗Sep-Pak C18柱[15]。

將干燥的牛乳寡糖粗品溶于200 μL 0.1% TFA溶液，然后上樣到Sep-Pak C18柱。收集過柱液體，用200 μL 0.1% TFA溶液潤洗收集試管，將收集的液體加入Sep-Pak C18中，收集過柱液體，此步驟重復2 次。最后用3 mL 0.1% TFA溶液沖洗Sep-Pak C18，收集過柱液體，所得到收集液體為牛乳寡糖樣品。

牛乳寡糖的除鹽富集采用石墨化柱，除鹽步驟也分為活化、平衡、載樣過柱、脫鹽、洗脫等，依次用3 倍柱體積的80%乙腈溶液（含0.1% TFA）和純水通過柱體；將上一步的收集液上樣，控制流速約0.5～1.0 mL/min（重復此步驟）；用3 倍柱體積的純水通過柱體，為吸附于柱底PGC填料上的寡糖除鹽；最后用0.5 mL 10%乙腈溶液（含0.1% TFA）、20%乙腈溶液（含0.1% TFA）、40%乙腈溶液（含0.1% TFA）將寡糖分步洗脫，收集洗脫液濃縮凍干用于衍生化。

1.3.3 牛乳寡糖衍生化試劑的選擇及高效液相色譜條件的優化

1.3.3.1 牛乳寡糖1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮的衍生化

將上一步干燥后的樣品溶于50 μL氨水，加入50 μL 1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮-甲醇溶液（0.5 mol/L），70 ℃條件下反應35 min，反應后冷卻到室溫，然后加入1 mL的超純水進行真空干燥（此步驟重復2 次），向干燥的物質中分別加入1 mL的超純水和1 mL的氯仿，用渦旋儀充分混合后靜置，除去有機相（此步驟重復3 次），將最后得到的水相15 493×g離心2 min，抽取上清液用超純水稀釋10 倍后用于高效液相色譜優化分析[17]。

1.3.3.2 牛乳寡糖2-氨基吖啶酮的衍生化

2-氨基吖啶酮是公認的熒光疏水性的標記分子，被成功地用于衍生和分離各種復雜的寡糖[16-17]。干燥后的樣品用2-氨基吖啶酮衍生化，即將純化后干燥的牛乳寡糖溶于50 μL 0.1 mol/L 2-氨基吖啶酮（用冰醋酸和二甲基亞砜按3∶17的體積比溶解），2-氨基吖啶酮的氨基與糖的還原端（醛基）發生親核反應，生成Schiff堿，其次加入50 μL新鮮配制的1 mol/L硼氰化鈉溶液，上一步生成的Schiff堿隨即被硼氰化鈉專一地還原成穩定的二級胺。反應后經11 000×g離心3 min，然后在45 ℃溫度條件下反應4 h，最后加入150 μL 50%二甲基亞砜溶液直接用于高效液相色譜優化分析[18]。

1.3.3.3 高相液相色譜條件

XBridge氨基柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相A：乙腈，流動相B：10 mmol/L的甲酸銨（pH 4.5）溶液；流速0.5 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長254 nm（采用紫外檢測器）；梯度洗脫條件為：0～27 min，95%～85% A；27～29 min，85% A；29～31 min，85%～84% A；31～33 min，84% A；33～37 min，84%～83% A；37～48 min，83%～79% A；48～64 min，79%～73% A；64～66 min，73% A；66～74 min，73%～69% A；74～78 min，69%～68% A；78～85 min，68%～65% A。

1.3.3.4 質譜條件

電噴霧離子源，正離子模式；噴霧電壓為4.5 kV；負離子模式噴霧電壓為－3.5 kV。一級、二級離子質量掃描設為m/z 300～1 000和m/z 1 000～2 000。加熱模塊和曲形脫溶劑管溫度均為200 ℃，氮氣流速為1.5 L/min，離子累計時間為10 ms。高純度氬氣作為碰撞誘導解離及冷卻氣，檢測器電壓為1.58 kV。離子阱真空度1.1×10－2Pa，飛行時間真空度1.2×10－4Pa。檢測模式正、負離子切換檢測[19]。

2 結果與分析

2.1 衍生化產物的結構

2.1.1 1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮試劑的衍生化

一分子的1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮和糖類物質的還原端發生縮合反應，在加熱條件下失水生成不飽和的單分子衍生物，然后繼續與另一分子的1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮發生Micheal 1,4加成，最終使糖物質加上2分子的1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮，反應式如圖1所示[20]。

圖 1 1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮與寡糖的衍生化反應原理Fig. 1 Derivatization reaction mechanism of oligosaccharides with PMP

2.1.2 2-氨基吖啶酮試劑的衍生化還原胺化法是在糖鏈的還原端上引入發色基團的最通用方法。先是2-氨基吖啶酮的氨基與糖的還原端發生親核反應，消除一分子水后生成Schiff堿，然后Schiff堿隨即被硼氰化鈉專一地還原成二級胺，在眾多衍生化方法中，還原胺化法由于產物穩定，是常用的衍生化方法之一，該衍生化方法穩定、衍生后可提高糖的檢測靈敏度，反應過程如圖2所示[21]。

圖 2 2-氨基吖啶酮與寡糖的衍生化反應原理Fig. 2 Derivatization reaction mechanism of oligosaccharides with 2-AMAC

2.2 衍生化試劑及高效液相色譜條件的確定

圖 3 1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮衍生化（a～c）和2-氨基吖啶酮衍生化（d、e）牛乳寡糖高效液相分離圖譜Fig. 3 HPLC profiles of PMP- (a, b and c) and AMAC- (d and e) derivatized milk oligosaccharides under different conditions

對牛乳寡糖進行1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮衍生化后進行高效液相色譜條件的優化，根據XBridge氨基柱的特性，初次設定流動相條件為：梯度洗脫0～40 min，95%～65% A，如圖3a所示。根據圖3a并參照高效液相色譜分離的原則和XBridge氨基柱的特點進行后續的高效液相色譜條件的優化，選取部分優化結果見圖3b，梯度洗脫條件為0～10 min，90%～70% A；20～40 min，70%～60% A，圖3c梯度洗脫條件為20～40 min，70%～65% A。從部分優化結果來看，圖3a峰形較標準且大小峰有20 個左右，故將圖3a流動相條件設為最佳色譜條件，即梯度洗脫0～40 min，95%～65% A。

對牛乳寡糖進行2-氨基吖啶酮衍生化后進行高效液相色譜條件的優化，根據XBridge氨基柱的特性，初次設定流動相條件為：梯度洗脫0～50 min，95%～65% A，結果見圖3d。根據圖3d參照高效液相色譜分離的原則和XBridge氨基柱的特點進行后續的高效液相色譜條件的優化，最終獲得最優高效液相色譜條件為：梯度洗脫0～27 min，95%～85% A；27～29 min，85% A；29～31 min，85%～84% A；31～33 min，84% A；33～37 min，84%～83% A；37～48 min，83%～79% A；48～64 min，79%～73% A；64～66 min，73% A；66～74 min，73%～69% A；74～78 min，69%～68% A；78～85 min，68%～65% A。由圖3e可知，所得各峰相對規則，分離效果較優，約有67 個峰，達到了盡可能多的鑒定出牛乳寡糖成分的條件。

從2 種衍生化試劑所得的最佳色譜圖譜來看2-氨基吖啶酮衍生化效果比較好，且1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮在衍生化過程中反應程度難以控制[22]，并沒有2-氨基吖啶酮衍生化產物穩定，故將2-氨基吖啶酮作為本實驗的衍生化試劑。

2.3 質譜分析

將衍生化后的牛乳寡糖用優化好的流動相條件通過高效液相色譜-串聯離子阱飛行時間質譜測定，由于寡糖質量掃描范圍為m/z 300～2 000，為獲得更好的精確度，將其分為兩部分進行正負離子模式掃描，分別為質量掃描范圍為m/z 300～1 000（圖4a）和m/z 1 000～2 000（圖4b）。

圖 4 不同質量掃描范圍高效液相色譜圖Fig. 4 HPLC profiles in different m/z ranges

在質量掃描范圍為m/z 300～1 000的質譜測定中共鑒定6 種糖成分，其中4 種為寡糖，其余為單糖和雙糖；質量掃描范圍為m/z 1 000～2 000的質譜測定中鑒定出3 種乳寡糖。2個掃描段共測定出7 種乳寡糖；本實驗正負離子模式同時進行，寡糖大部分在負離子模式下電離出峰，其中正離子模式下共測到3 種乳寡糖，負離子模式測到4 種，寡糖在負離子模式下測定結果相對較好。實驗所測得的7 種乳寡糖結構如表1所示。

隨后，通過電噴霧離子-串聯質譜對分析出的寡糖進行糖單元組成的確定。構成牛乳寡糖的單糖包括Glc、Gal、GlcNAc、Fuc、NeuAc和NeuGc。根據斷裂碎片的質荷比（m/z）可以判斷寡糖的單糖組成[23-25]。用二級質譜分析2-氨基吖啶酮標記的牛乳寡糖時，質荷比相差162的碎片表示存在Hex，質荷比相差146的碎片表示存在Fuc，質荷比相差203和291的碎片表示存在HexNAc和NeuAc[26-27]。6’-NeuGcLacNAc是牛乳中酸性寡糖，圖5a為正離子模式下的6’-NeuGcLacNAc（m/z 885.294 8，保留時間79.503 min）的一級圖譜。可以看出其準分子為m/z 885.294 8[M+H]+峰。為確證其結構組成對其進行電噴霧離子-串聯質譜分析，碰撞能量為32 eV，得到的二級圖譜如圖5b所示。

表 1 7 種牛乳寡糖的結構Table 1 Structural analysis of 7 milk oligosaccharides

圖 5 6’-NeuGcLacNAc（a、b）和α3’-GalNAcL（c、d）在正離子模式下質譜圖Fig. 5 Mass spectra in positive ion mode of 6’-NeuGcLacNAc (a and b) and α3’-GalNAcL (c and d)

由圖5 a、b可見，在正離子模式下，6’-NeuGcLacNAc產生2 種碎片離子，分別是m/z 561.197 4和m/z 397.132 5。m/z 561.197 4是由母離子m/z 885.294 8斷裂一分子的NeuGc（質量數324）形成，m/z 397.132 5（一分子的GlcNAc加一分子2-氨基吖啶酮）是離子m/z 561.197 4失去一分子的Gal和2 個氫離子產生的，由此可知6’-NeuGcLacNAc由一分子的NeuGc、一分子的Gal和一分子的GlcNAc組成（斷裂方式見圖5b）。

根據文獻報道α3’-GalNAcL存在3 個同分異構體，分別為β3’-GalNAcL、β6’-GalNAcL和β-GlcNAclactose。圖5c為α3’-GalNAcL（β3’-GalNAcL或β6’-GalNAcL或β-GlcNAclactose m/z 742.289 2，保留時間62.313 min）正離子模式下的一級圖譜。可以看出其準分子為m/z 742.289 2 [M＋H]＋峰。為確證其結構組成對其進行電噴霧離子-串聯質譜分析，碰撞能量為30 eV，得到的二級圖譜如圖5d所示。在正離子模式下，α3’-GalNAcL（β3’’-GalNAcL、β6’-GalNAcL和β-GlcNAclactose）產生4 種碎片離子，分別是m/z 580.243 3、562.237 8、415.115 2、235.076 8。m/z 580.243 3是母離子斷裂一分子的Glc產生的，m/z 562.237 8是由m/z 742.289 2失去一分子的Glc和一分子的H2O（質量數162+18）得到的。m/z 415.115 2是一分子的HexNAc加上一分子的2-氨基吖啶酮得到的（即由母離子斷裂2 個Hex得到）。m/z 235.076 8是由m/z 415.115 2斷裂一分子的Gal產生。由此可以得出α3’-GalNAcL（β3’-GalNAcL、β6’-GalNAcL和β-GlcNAclactose）由一分子的Gal、一分子的Glc和一分子的HexNAc組成，斷裂方式見圖5d，如果需要區分同分異構體需要進一步的實驗確定。采用類似的質譜解析技術，通過二級質譜分析確定了其余5 種寡糖的結構。由于乳寡糖含量極低使對其的測定分析存在極大挑戰。采用該方法可以快速鑒定出牛乳中含量較豐富的寡糖成分，該實驗結果與Dallasd[28]、Sundekilde[29]等實驗結果一致，為鑒定其他的未知峰以便測定更多的乳寡糖成分，可以將其他峰分別收集進行基質輔助激光解吸離子化-傅里葉變換離子回旋共振質譜和高效液相色譜-芯片/四極桿-飛行時間質譜分析[2,30]。

3 結 論

采用分段質譜掃描分析可以準確鑒定牛乳中寡糖成分，并達到了預期的測定結果。二級質譜的分析也進一步確定了寡糖的單糖組成。由于本實驗只做到電噴霧離子-串聯質譜，并不能更好區分同分異構體和獲得寡糖單糖組成的鍵位結構，如需具體的結構信息需要后續的測定分析。

綜上所述，通過對原料乳脫脂、除蛋白，分離純化后進行2-氨基吖啶酮衍生化并采用高效液相色譜技術實現了對牛乳寡糖的有效分離。采用高效液相色譜-串聯離子阱飛行時間質譜對牛乳中寡糖進行測定，鑒定了7 種牛乳寡糖并實現了對該7 種牛乳寡糖結構組成的分析。結果表明，本實驗方法簡單可行、可用于牛乳寡糖的分離和測定。

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Comparative Analysis of Oligosaccharides in Milk Based on Two Different Derivatization Methods by HPLC-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Xinxin1,2, LU Jing2, LIU Lu2, PANG Xiaoyang2, ZHANG Shuwen2, LI Cheng1,*, Lü Jiaping2
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Yaan 625014, China; 2. Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

In the present study, Sep-Pak C18and porous graphitized carbon column chromatographies were sequentially used to separate and purify oligosaccharides f rom defatted and deproteinated milk. After derivatization w ith phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) or 2-aminoacridone (AMAC), the oligosaccharides were analyzed by high-performance liquid chromatography ion trap time of flight tandem mass spectrometry (HPLC-IT-TOF-MS). AMAC was a better derivatization agent than PMP, since they produced about 67 and 20 chromatographic peaks, respectively. Finally, seven lacto-oligosaccharides were identified under optimized HPLC conditions, and their monosaccharide compositions were determined.

milk oligosaccharides; 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one; 2-aminoacridone; high-performance liquid chromatography ion trap time of flight tandem mass spectrometry (HPLC-IT-TOF-MS)

10.7506/spkx1002-6630-201710027

O629.1

A

1002-6630（2017）10-0162-06

陳新新, 蘆晶, 劉鷺, 等. 基于2 種衍生化方法對牛乳中寡糖的高效液相色譜-質譜聯用分析[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 162-167. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710027. http://www.spkx.net.cn

CHEN Xinxin, LU Jing, LIU Lu, et al. Comparative analysis of oligosaccharides in milk based on two different derivatization methods by HPLC-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(10): 162-167. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710027.http://www.spkx.net.cn

2016-08-23

國家自然科學基金青年科學基金項目（1401514）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B10）；公益性行業（農業）科研專項（201303085）

陳新新（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：xinxin1190@163.com

*通信作者：李誠（1964—），男，教授，碩士，研究方向為畜產品加工與質量安全控制。E-mail：lichenglcp@163.com