桑葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑產生菌的分離鑒定及誘變選育

朱孟峰，許 偉，邵 榮，韋 萍

桑葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑產生菌的分離鑒定及誘變選育

朱孟峰1,2,3，許 偉2,3,*，邵 榮2,3，韋 萍1,*

（1.南京工業大學藥學院，江蘇 南京 211816；2.鹽城工學院海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051；3.江蘇省海洋灘涂生物化學與生物技術重點建設實驗室，江蘇 鹽城 224051）

從桑葉中篩選出一株糖尿病潛在治療藥物（α-葡萄糖苷酶抑制劑）產生菌，為進一步提高抑制劑量，采用常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）技術進行了誘變育種，并初步研究其理化性質及穩定性。在分離得到的188 株桑葉內生菌中，以4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）法篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，篩選到一株細菌XuW-LB-188，其發酵上清液對α-葡萄糖苷酶抑制率達52.67%。根據菌株形態特性及16S rDNA序列，初步鑒定為萎縮芽孢桿菌。對此菌株進行ARTP誘變，高通量篩選880 株突變株，其中突變株T-690抑制活性較出發菌株提高了40.61%，抑制率高達73.25%。實驗結果表明，該α-葡萄糖苷酶抑制劑主要存在于發酵液中，是一種極性較大的水溶性胞外產物，且具有良好的熱穩定性。

α-葡萄糖苷酶抑制劑；桑葉；內生菌；篩選；常壓室溫等離子體誘變；萎縮芽孢桿菌

α-葡萄糖苷酶抑制劑[1]是一類用于治療Ⅱ型糖尿病的口服降糖藥物，其通過可逆性地與小腸刷狀絨毛上的α-葡萄糖苷酶結合，從而減緩雙糖和寡糖的分解吸收，進而降低餐后高血糖，作用溫和、毒副作用小。阿卡波糖和米格列醇為已上市的2 種α-葡萄糖苷酶抑制劑，前者來源于游動放線菌（Actinopanes sp.）[2]，后者也存在于淺紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）[3]發酵液。從早期短葉紅豆杉中分離出產紫杉醇的共生菌[4]，到近期從長春花中分離出產長春堿的共生菌[5]，證明某些內生菌的代謝產物具有與宿主植物相同或相似的活性結構及功能。桑葉、桑白皮等作為傳統中藥，具有良好的降血糖功能[6]，鄭麗屏等[7]就從桑樹中分離出一株內生真菌，對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性。

微生物是α-葡萄糖苷酶抑制劑較為理想有效的來源，菌種的誘變選育則是改良菌種的重要手段之一。其中，基于大氣壓射頻輝光放電的常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）菌種選育技術，具有條件溫和、安全性高、操作簡單、誘變迅速、突變率高等特點[8-9]，獲得普遍認可和廣泛應用。其產生的中能活性粒子不僅可直接改變核苷酸水平的分子結構[10]，還可通過作用于細胞而間接影響胞內遺傳物質[11]，阿維菌素[12]、奧利萬星中間體[13]等產生菌經ARTP誘變后，產量均大幅提高。本實驗以桑葉為材料，進行產α-葡萄糖苷酶抑制劑菌株的分離與鑒定，對篩選到的菌株進行ARTP誘變以提高抑制劑產量，并對抑制劑理化性質進行初步分析，同時為α-葡萄糖苷酶抑制劑的發酵條件優化及分離純化提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮桑葉采自江蘇、浙江、安徽、云南、廣東等13 省，包括野生桑葉及種植桑葉，共計41 份樣品。

1.1.2 試劑與培養基

酵母粉、蛋白胨 英國Oxoid公司；α-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20，來源于釀酒酵母） 美國Sigma-Aldrich公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG） 上海晶純生化科技股份有限公司。

0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：NaCl 8.00 g/L、KCl 0.20 g/L、Na2HPO41.44 g/L、KH2PO40.24 g/L，調pH 7.2；甘油-氯化鈉溶液：每升含甘油50 mL、NaCl 8.00 g。

LB培養基：酵母粉5.00 g、蛋白胨10.00 g、NaCl 10.00 g、蒸餾水1 000 mL，調pH 7.0～7.2，固體培養基時加入瓊脂15.00～18.00 g；馬鈴薯-蔗糖培養基：馬鈴薯200.00 g、蔗糖20.00 g、蒸餾水1 000 mL，自然pH值，固體培養基時加入瓊脂15.00～18.00 g。所有培養基及溶液均121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；MLS-3751全自動高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司；JY92-ⅡN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技福分有限公司；SpecraMax 190酶標儀 美國Molecular Devices公司；Allegra X-30R高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養箱 太倉實驗設備廠；PB-10酸度計 德國Sartorius公司；常壓室溫等離子體育種機無錫思清源生物科技公司；旋渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；24深孔板 常州英德生物科技有限公司；250D培養箱 國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 內生菌的分離

取桑樹的莖、葉組織，用自來水反復沖洗至表面無異物，擦干并用無菌水清洗3 次，在75%酒精中浸泡3～5 min，將其取出轉入到體積分數為3%的次氯酸鈉溶液中浸泡5 min，無菌水沖洗3 次，備用。

將處理后的桑葉放入無菌研缽中，加PBS研磨，上清液梯度稀釋后涂布于LB和馬鈴薯-蔗糖平板，重復3 次，分別置于35 ℃和28 ℃的恒溫箱中培養48 h。其中LB平板用于內生細菌的分離，馬鈴薯-蔗糖平板用于內生真菌的分離。最后一次沖洗的無菌水也進行上述操作，用于表面無菌的驗證[14]。

1.3.2 菌落純化及發酵培養

通過平板劃線進一步純化菌落，挑取純化后單菌落接入LB或馬鈴薯-蔗糖液體培養基中（250 mL錐形瓶內含50 mL培養基），分別于35 ℃和28 ℃搖床中100 r/min培養48 h。

1.3.3 菌體胞內及胞外產物提取

搖瓶發酵結束后，4 ℃、12 000 r/min離 心10 min，分成上清液及菌絲體，上清液即為微生物胞外產物，冷凍保存，用于α-葡萄糖苷酶抑制活性測定。收集菌體沉淀，用PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）洗滌3 次后，制成菌懸液，于冰水浴中超聲波破碎[15]，將破碎液4 ℃、12 000 r/min離心10 min，所得上清液即為微生物胞內提取物，冷凍保存，用于α-葡萄糖苷酶抑制活性測定。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

以PNPG法[16]篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑是一種快速經典有效的篩選方法。該方法基于PNPG在α-葡萄糖苷酶催化下生成具有特定光吸收的對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）這一反應，其吸光度的變化可用于酶活力及抑制劑活力測試。

具體操作步驟[17]：在96 孔酶標板中加入10 μL，1 U/mL（酶活力定義：pH 6.8，37 ℃條件下1 min內生成1 μmol葡萄糖的酶量）α-葡萄糖苷酶（緩沖溶液溶解），80 μL，0.1 mol/L磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀（pH 6.8），20 μL測試樣品（陰性對照孔加入空白培養基），37 ℃保溫10 min后，加入40 μL，2 mg/mL PNPG，用酶標儀于405 nm波長處分別測定反應零時間OD值（OD1）與反應20 min后的OD值（OD2）。抑制率根據公式（1）計算。

1.3.5 菌種鑒定

依據《伯杰細菌鑒定手冊》[18]與《真菌鑒定手冊》[19]，通過菌落形態及簡單染色對微生物進行初步分類。對篩選出的高抑制率菌株，以引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴增細菌16S rDNA，以NS1（5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’）、NS8（5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’）擴增真菌18S rDNA，克隆測序后，利用GenBank基因數據庫的BLAST進行序列同源性比較分析，并構建系統發育進化樹。

1.3.6 ARTP誘變操作

菌懸液的制備：取1 mL對數生長期的出發菌株培養液，8 000 r/min離心10 min，棄上清液 ，用無菌PBS洗滌2 次以去除培養基，最后菌體重懸于甘油-氯化鈉溶液中，細胞終濃度為106～107CFU/mL，用于ARTP處理。

ARTP處理預實驗[20]：為保證突變的有效性，放電射流區溫度不應高于40 ℃，輸出功率、輻照距離、氣流量等參數設定一般推薦為120 W、2 mm、10 L/min[8]。按上述參數處理樣品載片，分別考察輻照時間0（對照）、10、20、30、40、50、60 s對細菌致死率的影響，每個時間梯度進行3 次平行實驗。處理過的樣品稀釋涂平板，計數菌落數，根據公式（2）計算致死率，并獲得致死率曲線。

ARTP具體操作：取10 μL菌懸液均勻涂于無菌樣品載片，在設定的系統參數及選取的處理時間下進行樣品誘變，樣品處理完畢后，用無菌鑷子將載片放至裝有1 mL無菌PBS的EP管中。充分振蕩，使附著在菌物載片上的微生物洗脫至液體中，形成新的菌懸液。對新的菌懸液進行適當稀釋后涂布，35 ℃條件下培養24 h。

1.3.7 高通量篩選方法

24深孔板培養結合96 孔酶標板抑制率檢測可實現突變菌株的高通量篩選。根據菌落生長的大小和豐度，用無菌牙簽挑取單菌落接種于裝有培養基的24深孔板（2 mL/孔），35 ℃、100 r/min培養48 h。菌液一部分用于菌種保藏，另一部分8 000 r/min離心10 min，取上清液，測定α-葡萄糖苷酶抑制率，每個樣品進行3 次平行實驗。

1.3.8 突變株遺傳穩定性分析

將經過篩選得到的正突變幅度最大（抑制活性最高） 的菌株接種至固體培養基上傳代培養10 代，并將各代菌體分別接種于液體培養基中，35 ℃、100 r/min培養72 h，測其抑制活性，檢測所選突變株的遺傳穩定性。

1.3.9 活性物質的早期鑒定

活性成分在發酵液中的分布：分別測定胞內產物及發酵上清液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

熱穩定性測試：取發酵上清液50 mL分裝于5 支試管（50 mL）中，于沸水浴中分別保溫5、10、30、60、120 min，冷卻后用蒸餾水補至原體積，測定原始發酵液及沸水浴不同時間后的發酵液活性，重復測定3 次。

活性物質的極性測試[17]：取4 支試管，每管裝入5 mL發酵上清液，分別加入5 mL的正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚，多次混勻充分萃取。以原始發酵上清液為對照，分別檢測各管水相的抑制活性。

2 結果與分析

2.1 內生菌的分離

通過對13 個省41 份桑葉樣品進行篩選，總計獲得共生菌189 株，初步鑒定細菌143 株，真菌46 株，經純化后，分別保存于固體斜面。植物中一般都有共生菌的存在，無論是內生真菌還是內生細菌，多能使植物獲益，如內生固氮、植物促生長和生物防治等作用[21]。此外，越來越多的功能性次級代謝產物從內生菌中發現并得以利用[22]。

2.2 產α-葡萄糖苷酶抑制劑內生菌的篩選

圖 1 抑制率分布圖Fig. 1 Distribution of α-glucosidase inhibitory activity of 189 isolates

經過對189 株微生物胞外產物及胞內提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行測試，抑制率小于10%的共157 株，抑制率為10%～30%的共27 株，抑制率為30%～50%的共4 株，分別為XuW-PSA-06、XuWLB-76、XuW-LB-79（胞內）、XuW-LB-91，另有一株共生菌XuW-LB-188發酵液抑制率高達52.67%。共生菌抑制率分布情況如圖1所示。本實驗中，抑制α-葡萄糖苷酶活性物質多富集于胞外，胞內提取物一般無抑制活性，即便有也較低。這與已報道的產α-葡萄糖苷酶抑制劑微生物中，所產抑制劑多為胞外次級代謝產物相符[23-25]。

2.3 XuW-LB-188菌落及形態觀察

圖 2 XuW-LB-188菌落形態（A～C）、革蘭氏染色（D）及芽孢染色（E）Fig. 2 Colony, Gram staining and spore staining of strain XuW-LB-188

如圖2所示，LB平板上接種XuW-LB-188，35 ℃培養12 h即可見明顯菌落，菌落圓形、不透明、光滑、濕潤，24 h后菌落呈不規格圓形、乳白色、形成褶皺，48 h后菌落密集處開始產生棕褐色色素，與萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）[26]菌落形態十分相近。經鑒定，XuW-LB-188為革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀，芽孢呈橢圓形。

2.4 16S rDNA序列測定及系統發育樹

圖 3 XuW-LB-188菌株16S rDNA PCR擴增結果Fig. 3 PCR amplification of 16S rDNA gene of strain XuW-LB-188

圖 4 XuW-LB-188菌株基于16S rDNA的系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree for strain XuW-LB-188 based on 16S rDNA sequence

以引物27F、1492R，擴增16S rDNA全序列，獲得一條1 392 bp的DNA片段，條帶清晰、與實驗設計相符（圖3）。在NCBI的GenBank數據庫中進行BLAST比對，并構建系統發育樹（圖4），結果表明XuW-LB-188與萎縮芽孢桿菌同屬于一個分支，初步確定XuW-LB-188為萎縮芽孢桿菌。產α-葡萄萄糖苷酶抑制劑的微生物種屬分布較廣，現已報道的包括曲霉（Aspergillus terreus）[24]、青霉（ Penicillium citreonigrum）[27]、鏈霉菌屬（Streptomyces）[28]、乳酸菌屬（Lactobacillus）[23]、芽孢桿菌屬（Bacillus）[29-30]等。

2.5 ARTP誘變選育

2.5.1 ARTP致死率曲線測定

圖 5 ARTP誘變致死率曲線Fig. 5 Mortality rate curve from ARTP mutation

根據1.3.6節中方法測試并繪制致死率曲線，如圖5所示。ARTP照射時間與XuW-LB-188的致死率存在著明顯的劑量效應關系，與王興吉等[31]誘變枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的致死率曲線相近。在0～30 s，致死率隨照射時間迅速上升至90%，30 s后，致死率隨照射時間緩慢升高，50 s后致死率高達99%以上。有報道稱[32]較高致死率可提高突變及正突變比例，因此后續實驗誘變處理時間選用50 s。

2.5.2 誘變菌株的篩選

圖 6 正突變株及原始菌株抑制活性Fig. 6 α-Glucosidase inhibitory activity of the original and positive mutant strains

以篩選出抑制活性最高的XuW-LB-188為出發菌株，在輸出功率120 W、輻照距離2 mm、氣流量10 L/min、載樣量10 μL、輻照時間50 s的條件下，利用24深孔板培養聯合96 孔酶標板檢測，實現了誘變菌種的高通量篩選。每次實驗篩選88 株突變菌（共4 板，每板設1 孔接種原始菌種作為對照，1 孔未接種作為空白），先后進行10 次實驗，篩選突變菌株880 株，正突變菌株26 株。選取10 株正突變量較高的菌株示于圖6，其中T-690突變株抑制率高達73.25%，相較于出發菌株提高了40.61%，說明ARTP誘變對于提高菌株α-葡萄糖苷酶抑制劑產量具有較好的效果。

近年來，科研工作者以PNPG法獲得了一批潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑產生菌。此法中以抑制率作為前期篩選及優化的參考指標行之有效，操作簡單快捷。本實驗中，突變株T-690抑制活性遠高于枯草芽孢桿菌B2[29]，與萎縮芽孢桿菌S-J-X-4[14]相當。

圖 7 T-690遺傳穩定性Fig. 7 Genetic stability of strain T-690

2.6 突變菌遺傳穩定性研究對突變菌株T-690進行固體平板10 次傳代培養，并測試每代的抑制活性，由圖7可知，發酵上清液對α-葡萄糖苷酶的抑制率變化甚微，說明突變株T-690遺傳穩定性良好，活性物質產量穩定。突變株T-690的高抑制活性及遺傳穩定性，為后續α-葡萄糖苷酶抑制劑的工業發酵及分離提供了優良的菌種。

2.7 活性物質初步分析

圖 8 沸水浴處理時間對抑制率的影響Fig. 8 Effect of boiling water bath treatment time on α-glucosidase inhibitory activity

胞內產物及發酵上清液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性分別為2.10%和72.83%，說明抑制劑主要存在于發酵上清液中，為一種胞外產物。發酵上清液經不同時間熱處理后，抑制率變化如圖8所示。隨著沸水浴時間的延長，抑制活性變化幅度較小。由此可知，發酵液中活性組分具有良好的熱穩定性，同時說明此物質為非蛋白質等易熱變性的組分。在后期分離過程中，可通過熱處理去除發酵液中的蛋白質，也可通過減壓蒸餾的方式進行濃縮。

選用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等不同極性的有機溶劑對發酵上清液中的活性物質進行萃取分離，發現活性物質仍主要保留在水相中。結果表明，潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑是一種極性較大的胞外產物。已知極性對于分離純化有著重要意義，有助于分離方法的選擇及分離方案的設計。

桑葉中已知具有降糖活性的物質包括黃酮（蕓香苷、槲皮素等）、多糖、生物堿（1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）、N-甲基-1-DNJ等）等[33]，根據內生菌次生代謝產物和宿主植物次生代謝產物結構及活性的相似性，以及其極性和熱穩定性推斷，T-690所產活性物質很有可能為DNJ或其結構類似物。

3 結 論

從13 個省41 份桑葉樣品中，總計獲得共生菌189 株，以PNPG法篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，其中XuWLB-188發酵上清液抑制率高達52.67%，是一株具有潛在藥用價值的微生物。16S rDNA序列分析結果表明，該菌株為萎縮芽孢桿菌。

以XuW-LB-188為出發菌株，通過ARTP誘變實驗，繪制致死率曲線并確定了最佳誘變時間為50 s。高通量篩選880 株突變菌株，共獲得26 株正突變菌株，其中突變株T-690抑制率最高，為73.25%，相較于出發菌株提高了40.61%。同時，10 次傳代培養實驗驗證了其遺傳穩定性。

α-葡萄糖苷酶抑制劑分布、熱穩定性及極性實驗結果表明：活性物質為胞外產物，主要存在于發酵液中，具有很好的熱穩定性，是一種極性較大的水溶性物質。

后續研究工作將對此活性物質進行分離提純及結構鑒定，并利用響應面方法優化菌株T-690的發酵條件，以期提高抑制劑的產量。

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Isolation, Identification and Mutation Breeding of an Endophytic Strain Producing α-Glucosidase Inhibitor from Mulberry Leaf

ZHU Mengfeng1,2,3, XU Wei2,3,*, SHAO Rong2,3, WEI Ping1,*
(1. School o f Pharmaceutical S ciences, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, China; 2. School of Marine and Biology Engineering, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224051, China; 3. Jiangsu Key Laboratory of Biochemistry and Biotechnology of Marine Wetland, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224051, China)

A strain capable of producing α-glucosidase inhibitor as a potential antidiabetic agent from mulberry leaf was isolated. Subsequently, atmospheric and room temperature plasma (ARTP) was applied to mutagenize the isolated strain for improved production of α-glucosidase inhibitors. At the same time, the physicochemical properties and stability were investigated preliminarily. Out of the 188 isolated strains, a bacterial strain named XuW-LB-188 was selected after examination of α-glucosidase inhibitory activity using 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(PNPG) as a substrate, giving an inhibition percentage of 52.67% in the fermentation supernatant. On the basis of its morphological characteristics and 16S rDNA gene sequence, the strain was preliminarily identi ed as Bacillus atrophaeus. After ARTP mutation breeding and subsequent high-throughput screening, T-690 was selected out of 880 mutant strains, whose inhibition rate (73.25%) against α-glucosidase was increased by 40.61% compared with that of the original strain. The experiment results indicated that the α-glucosidase inhibitor mainly existed in the fermentation broth. Consequently, the inhibitor was an extracellular product. Moreover, it had high polarity and good thermostability.

α-glucosidase inhibitor; mulberry leaf; endophytes; screening; atmospheric and room temperature plasma (ARTP); Bacillus atrophaeus

10.7506/spkx1002-6630-201710019

Q939.97

A

1002-6630（2017）10-0111-06

2016-08-18

江蘇省產學研前瞻性項目（BY2015057-29）

朱孟峰（1991—），男，碩士研究生，研究方向為藥用微生物篩選及發酵。E-mail：278378538@qq.com

*通信作者：許偉（1976—），女，教授，博士，研究方向為工業微生物和酶工程。E-mail：xuweiyc@163.com韋萍（1961—），女，教授，博士，研究方向為微生物代謝調控及天然產物提取。E-mail：weiping@njtech.edu.cn

朱孟峰, 許偉, 邵榮, 等. 桑葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑產生菌的分離鑒定及誘變選育[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 111-116. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710019. http://www.spkx.net.cn

ZHU Mengfeng, XU Wei, SHAO Rong, et al. Isolation, identification and mutation breeding of an endophytic strain producing α-glucosidase inhibitor from mulberry leaf[J]. Food Science, 2017, 38(10): 111-116. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710019. http://www.spkx.net.cn