副干酪乳桿菌HD1.7發酵酸菜與商品酸菜代謝物比較與品質評價

趙 丹，杜仁鵬，王 瑤，王琪，那 金，郭尚旭，葛菁萍,*

（1.黑龍江大學生命科學學院，微生物省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；3.天津大學化工學院，天津 300072）

副干酪乳桿菌HD1.7發酵酸菜與商品酸菜代謝物比較與品質評價

趙 丹1,2，杜仁鵬1,3，王 瑤1，王琪1，那 金1，郭尚旭1，葛菁萍1,2,*

（1.黑龍江大學生命科學學院，微生物省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；3.天津大學化工學院，天津 300072）

以分離自酸菜發酵液的副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）HD1.7為發酵劑，構建酸菜發酵微生物生態系統研究模型，利用高效液相色譜和氣相色譜-質譜聯用技術，分析L. paracasei HD1.7發酵酸菜、自然發酵酸菜及8 種商品酸菜中 有機酸、酸度、亞硝酸鹽、VC、甘油、乙醇、甘露醇、2,3-丁二醇及揮發性風味成分的差別。結果表明：不同酸菜樣品中有機酸含量與酸度正相關，黑大酸菜、L. paracasei HD1.7發酵酸菜和袁滋袁味酸菜有機酸含量較高，分別為（13.21±0.13）、（13.20±0. 17）、（13.13±0.13）g/L。 此外，黑大酸菜、 L. paracasei HD1. 7發酵酸菜、邊府記酸菜中不僅亞硝酸 鹽含量顯著低于其他供試酸菜，VC含量顯著高于其他供試酸菜（P＜0.05），安全性、營養價值更高，而且風味物質含量豐富、感官品質 更優。研究結果有助于酸菜生產工藝監控和質量標準建立，對酸菜質量穩定性的提高和產業發展水平的提升具有實踐指導意義；同時展現了L. paracasei HD1.7在酸菜發酵的工業生產中的應用前景。

酸菜；品質；發酵劑；副干酪乳桿菌；代謝組學；質譜

Key words: pickle Chinese cabbage; quality; starter culture; Lactobacillus paracasei; metabonomics; mass spectrometry

蔬菜自古 以來是人類賴以生存的食物資源。我國是世界上蔬菜資源最為豐富的國家[1]。白菜（Brassica pekinensis）被譽為“百菜之王”，種植廣泛，營養富豐。酸菜是酸漬白菜的簡稱，在低濃度食鹽條件下，經微生物乳酸發酵而成，是我國東北地區特色傳統發酵食品[2]。據《本草綱目》記載，酸菜制作工藝至今己有430多年的歷史[3]。東北酸菜起源于遼寧，之后流傳到吉林和黑龍江兩省。酸菜具有清酸脆爽、色澤鮮亮、香氣撲鼻、開胃提神、醒酒去膩等特點，不但能增食欲、助消化，還可以降低膽固醇，促進人體對鈣、鐵、磷元素的吸收[4]。隨著人們生活水平的提高和交通運輸的便利，酸菜逐漸獲得全國乃至整個亞洲地區消費者的青睞。

酸菜腌制時，白菜不需滅菌，微生物多樣性豐富，浸出液代謝物組分多樣，生物因素與非生物因素內部及之間的相互作用十分復雜。微生物尤其是細菌群落演替，帶來代謝物組分變化，直接決定酸菜的品質和風味[5]，主要包括糖、有機酸、醇類、脂類、酮類、無機鹽、含氮物質、維生素、氨基酸、芳香物質等[6]。乳酸菌利用糖類進行乳酸發酵，產生大量的有機酸，包括乳酸、乙酸、丙酸、檸檬酸、丁二酸、琥珀酸及蘋果酸等。這些有機酸味道醇和、刺激性小，具有開胃、解油膩等，不僅賦予酸菜柔和的酸味，還可以降低發酵系統的pH值[7-8]。此外，醇類物質賦予酸菜輕快地醇香味。乙醇、丙醇、丁醇、2,3-丁二醇和苯乙醇是乳酸代謝途徑中重要的代謝產物，可以提供令人愉快的香氣[9]。同時，白菜中的脂肪被分解成脂肪酸和甘油，最終轉化為脂肪醇，具有水果香味[10]。

近些年來，很多學者開始關注酸菜發酵過程中風味物質的變化情況。楊利玲等[11]報道在發酵末期，加菌酸菜亞硝酸鹽含量為8.73 mg/kg，自然酸菜為16.84 mg/kg，低于國家標準限度值。蘇揚等[12]研究表明，泡菜液中的糖與酸呈現消長的趨勢，發酵液中產生了大量的乳酸；VC的損失較少。周相玲等[13]發現自然卷心菜發酵中有機酸組成和含量發生了較大的變化，總游離氨基酸的含量降低，揮發性風味物質的種類大大增加。

代謝組學技術指利用質譜（mass spectrometry， MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等技術平臺，對某一細胞、器官、生物體內維持其正常生長和功能的小分子代謝物或化學分子（小于1 500 D）進行同時定量測定，現已廣泛用于發酵食品的品質監控以及終產品質量鑒定[14]。Jeong等[15]利用NMR技術研究韓國水泡菜中代謝產物的變化，在發酵末期甘露醇為14.05 g/L，甘油為0.42 g/L，乙醇為0.93 g/L。為了迎合消費者對食品功能與安全的要求，研究者致力于酸菜產品的“低鹽化、低糖化、保健化”轉型。由于酸菜發酵過程中代謝組分多樣，多數成分含量較少，不易被檢測，且對其品質的監測評價尚缺乏統一的標準。雖然近些年對代謝物已有大量的研究，但是技術簡單落后，與韓國、日本等國家在發酵食品的分析鑒定上存在一定的差距。因此，本研究以分離自酸菜發酵液的副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）HD1.7為發酵劑，構建酸菜發酵微生物生態系統研究模型，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）等先進的代謝組學技術，分析L. paracasei HD1.7發酵酸菜、自然發酵酸菜及8種商品酸菜中有機酸、酸度、亞硝酸鹽、VC、甘油、乙醇、甘露醇、2,3-丁二醇及揮發性風味成分的差別，并與商品酸菜比較分析。研究結果有助于酸菜工藝的監控和質量標準的建立，對酸菜質量穩定性的提高和產業發展水平的提升具有實踐指導意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

發酵劑L. paracasei HD1.7，分離自自然酸菜發酵液，用于酸菜發酵，保藏于黑龍江大學微生物重點實驗室。

白菜 哈爾濱哈達蔬菜批發市場；食用鹽 中國鹽業總公司；8 種供試商品酸菜均購自哈爾濱中央紅超市學府路店，詳細信息見表1。

表 1 商品酸菜Table 1 Commercial pickled Chinese cabbage tested in this study

甲氧氨基鹽酸鹽、吡啶、三甲基氯硅烷、N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺 美國Sigma公司；食品中亞硝酸鹽含量測定試劑盒（編號A038） 南京建成科技有限公司；其他試劑均購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

乳酸細菌培養基（MRS）：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42 g，檸檬酸銨2 g，CH3COONa·3H2O 5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5，121℃高壓蒸汽滅菌15 min。1.2 儀器與設備

50 L塑料發酵罐 哈爾濱道外生活器具批發市場；A560紫外-可見分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；LC20A型HPLC儀 島津國際貿易上海有限公司；7890A/5975C GC-MS聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 酸菜發酵

自然發酵酸菜：選取優質實心白菜，晾曬2 d后去除壞葉，用自來水清洗干凈，20 kg白菜逐層放置于發酵罐中壓實，用25 L 3 g/100 mL的食鹽水浸泡，15～20 ℃密封靜置發酵。L. paracasei HD1.7發酵酸菜：取對數生長期的L. paracasei HD1.7作為直投發酵劑，以10%（V/V）的接種量接入到自然發酵酸菜罐，菌體終濃度為7×106個/mL。發酵時間31 d。

1.3.2 酸度的測定

不同酸菜樣品中酸度的測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[16]。

1.3.3 亞硝酸鹽含量的測定

采用食品中亞硝酸鹽測試盒測定酸菜中亞硝酸鹽的含量，具體方法按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 風味物質含量測定

VC含量參照李軍[17]的方法進行測定；甘露醇含量測定參照蔣華等[18]的方法；乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、甘油、乙醇、2,3-丁二醇含量利用HPLC檢測；揮發性化合物由GC-MS檢測，利用安捷倫數據分析工作站MSD Chemstation提取譜圖信息，NIST11.5數據庫鑒定化學物質。SIMCAP11.5+軟件分析可視化數據，建立主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squaresdiscriminate analysis，PLS-DA）模型，并通過響應置換檢驗法驗證模型是否過擬合。

1.3.5 酸菜感官評價

邀請10 名經過感官品評培訓的人員組成評定小組，依據表2對10 種不同品牌的酸菜進行品評[19]。

表 2 酸菜感官評價標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of pickled Chinese cabbage

1.4 數據統計分析

每項實驗均重復進行3 次，數據以±s表示。運用SPSS Statistics19軟件對數據進行統計學分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 酸度與有機酸含量的比較

圖 1 不同酸菜樣品中有機酸含量Fig. 1 Organic acid concentrations in different pickled Chinese cabbages

如圖1所示，黑大酸菜有機酸含量最高為（13.21±0.13）g/L，L. paracasei HD1.7發酵酸菜為（13.20±0.17）g/L，有機酸含量最低的為朱老六酸菜（10.63±0.25）g/L。10 種酸菜酸度范圍為（6.87±0.07）～（8.18±0.06）g/L，酸度與有機酸含量正相關，其中袁滋袁味酸菜的酸度顯著高于其他9 種酸菜（P＜0.05）。酸性環境能夠抑制許多有害微生物的生長，保持酸菜的硬脆度，防止VC的降解[20-21]。從有機酸組成上看，在所有酸菜樣品中，乳酸是含量最多的組分，占（59.02±0.54）%～（66.92±0.69）%。乳酸含量是酸菜營養程度的重要指標，不僅提供清爽可口的酸味，還具有防腐功能。L. paracasei HD1.7發酵酸菜中乳酸占有機酸總量的（66.33±1.18）%，且顯著高于其他樣品（P＜0.05）。檸檬酸可以為酸菜提供溫和爽快、有新鮮感的感官品質，也是酸菜發酵過程中風味形成的重要參考指標。10 種酸菜中，檸檬酸占有機酸含量僅次于乳酸，黑大酸菜中檸檬酸占有機酸總量的（32.53±2.03）%，顯著高于其他樣品（P＜0.05）。

2.2 亞硝酸鹽及VC含量的比較

圖 2 不同酸菜樣品中亞硝酸鹽與VC含量Fig. 2 The concentration of nitrite and VC in different pickle Chinese cabbages

如圖2所示，10 種酸菜中亞硝酸鹽含量范圍為（4.30±0.33）～（12.95±0.86）mg/kg，低于國家衛生標準20 mg/kg。其中L. paracasei HD1.7發酵酸菜亞硝酸鹽含量最低為（4.3±0.33）mg/kg，其次較低的為邊府記酸菜（（8.68±0.48）mg/kg）和黑大酸菜（（10.15±0.32）mg/kg）。L. paracasei HD1.7發酵酸菜VC含量最高為（392.47±3.26）mg/kg。L. paracasei HD1.7發酵酸菜、邊府記酸菜和黑大酸菜均以乳酸菌為發酵劑，產生大量的乳酸等有機酸，降低硝酸鹽還原酶的活性，加速亞硝酸鹽的降解，減慢VC的降解速度[22-23]。

2.3 重要風味物質含量的比較

圖 3 不同酸菜樣品中4 種重要風味物質含量Fig. 3 The concentrations of four important flavor compounds in different pickled Chinese cabbages

酸菜樣品中甘油、甘露醇、乙醇、2,3-丁二醇的含量存在顯著差別，沒有特異性關系（圖3）。甘油含量較高的為L. paracasei HD1.7發酵酸菜（（0.48±0）g/L）和邊府記酸菜（0.42±0）g/L；甘露醇含量較高的為黑大酸菜（（14.57±0.29）g/L）和L. paracasei HD1.7發酵酸菜（（14.47±0.06）g/L）；乙醇含量較多的為對照組酸菜（（0.96±0）g/L）和袁滋袁味酸菜（（0.95±0.01）g/L）；黑大酸菜和L. paracasei HD1.7發酵酸菜中2,3-丁二醇的含量均為（0.018±0）g/L。這些代謝產物的含量差異與pH值及有機酸含量沒有相關性。由于L. paracasei HD1.7發酵酸菜和黑大酸菜均以同型乳酸發酵菌作為發酵劑，其代謝產物主要 為乳酸，從而降低酸菜產品中乙醇、乙酸等異性乳酸發酵的代謝產物。這也許是由于商品酸菜在中人為加入山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉等食品添加劑所致。

2.4 揮發性化合物分析

由圖4可知，酸菜樣品之間代謝物存在顯著差異，能夠很好地分離。通過PLS-DA模型，篩選變量重要性投影大于1的組分作為差異代謝產物，主要為異硫氰酸甲酯、軟脂酸、十五烷、月桂烯、2-庚酮、2-甲基二硫等，均是酸菜風味的來源成分。在不同酸菜樣品之間，代謝物豐度也存在顯著差異（P＜0.05）。如表3所示，從種類上看，L. paracasei HD1.7發酵酸菜揮發性化合物種類共（59±1）種，最少的為自然發酵酸菜（51±0）種。從相對含量上看，L. paracasei HD1.7發酵酸菜（（94.87±8.23）%）和黑大酸菜（（94.49±7.32）%）揮發性化合物的總含量顯著高于其他酸菜（P＜0.05）。

表 3 不同酸菜樣品揮發性化合物種類及相對含量Table 3 Volatile flavor compounds and their relative contents in different pickled Chinese cabbages

圖 4 不同酸菜樣品代謝物PCA模型Fig. 4 PCA analysis of metabolites in different pickled Chinese cabbages

酯類是所檢測到揮發性化合物中種類最多、相對含量最為豐富的物質，己酸乙酯具有強烈的水果香氣，味甜爽口，對酸菜的風味貢獻十分重要[24-25]。酯類較高的為L. paracasei HD1.7發酵酸菜（（31.69±1.23）%）、黑大酸菜（（23.70±1.82）%），最少的為袁滋袁味酸菜（（20.06±1.38）%）。醛類可以賦予酸菜清香、堅果香和果香[26-27]。好大姐酸菜、古嫂子酸菜、翠花酸菜醛類物質較高分別為（1.18±0.09）%、（1.04±0.07）%、（1.47±0.32）%，邊府記酸菜含量最低為（0.59±0.04）%。不同酸菜中烷類物質的含量較高，但對酸菜風味的貢獻不大。酮類賦予食品奶油的香味，其中3-甲基-2-丁酮具有黃油的香氣、2-庚酮具有清香的氣味[25]。酮類較高的為黑大酸菜酸菜（（9.48±0.43）%）、袁滋袁味（（8.14±0.23）%），最少的為王致和酸菜（（3.00±0.11）%）。硫化物來源于白菜本身，含硫氨基酸最終轉化為含硫化合物[28]。L. paracasei HD1.7發酵酸菜中含硫化合物最高為（5.41±0.24）%，其次為黑大酸菜（（4.12±0.12）%），最少的為邊府記酸菜（（1.13±0.04）%）。乳酸菌可以將大白菜中的糖類轉化為乙醇、異戊醇等醇類，其賦予酸菜水果香、甜香以及酒香味[29-30]。L. p aracasei HD1.7進行乳酸主要產物的同型乳酸發酵，因此L. paracasei HD1.7發酵酸菜醇類物質的相對含量較低僅為（7.76±0.11）%，相對含量較高的為邊府記酸菜（（10.73±2.18）%）、朱老六酸菜（（11.10±2.62）%）。綜上可知，不同酸菜樣品揮發性化合物的組成及相對含量存在較大差別，無規律可尋，可能是由于外源的加入不同發酵劑、添加劑，且添加劑的含量和種類并不清楚，以及原材料的差異所導

致。L. paracasei HD1.7發酵酸菜中各揮發性化合物均處于較高水平，因此風味濃郁。

2.5 酸菜感官評價

圖 5 不同酸菜樣品感官評價結果Fig. 5 Sensory evaluation of different pickle Chinese cabbages

不同酸菜樣品感官評價評分從大到小依此是：黑大酸菜、L. paracasei HD1.7發酵酸菜、邊府記酸菜、袁滋袁味酸菜、古嫂子酸菜、朱老六酸菜、王致和酸菜、翠花酸菜、好大姐酸菜、自然發酵酸菜（圖5）。色澤、香氣、口味、脆度等指標進行評價，L. paracasei HD1.7發酵酸菜的分數高于其他9 種（P＜0.05）。L. paracasei HD1.7作為發酵劑可顯著改善酸菜的感官品質。

3 結 論

本研究以分離自酸菜發酵液的L. paracasei HD1.7為發酵劑，利用HPLC和GC-MS技術，比較分析了

L. paracasei HD1.7發酵酸菜、自然發酵酸菜及8 種商品酸菜樣品酸度及代謝物。黑大酸菜、L. paracasei HD1.7發酵酸菜、邊府記酸菜和袁滋袁味酸菜中有機酸含量顯著高于其他幾種酸菜（P＜0.05）。其中乳酸是有機酸中的主要成分。不同酸菜樣品中，酸度與VC含量呈正相關，與亞硝酸鹽含量呈負相關。其中L. paracasei HD1.7發酵酸菜中，酸度較高，VC含量最大，亞硝酸鹽含量最低。不同商品酸菜樣品中甘油、甘露醇、乙醇、2,3-丁二醇無規律性差異。不同樣品中揮發性風味物質的種類和相對含量均有顯著差異，L. paracasei HD1.7發酵酸菜揮發性成分種類最多，達（59±1）種，相對總含量為（94.87±8.23）%，顯著高于其他樣品（P＜0.05）。

L. paracasei HD1.7作為酸菜發酵劑，可以增加酸菜的酸度，降低亞硝酸鹽含量，防止VC降解，增加風味物質種類和含量，從而提高酸菜安全性和營養價值。

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Comparative Evaluation of Metabolite Composition and Quality of Lactobacillus paracasei HD1.7 Fermented and Commercial Pickled Chinese Cabbage

ZHAO Dan1,2, DU Renpeng1,3, WANG Yao1, WANG Qi1, NA Jin1, GUO Shangxu1, GE Jingping1,2,*
(1. Key Laboratory of Microbiology, Life Science College, Heilongjiang University, Harbin 150080, China; 2. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education, Heilongjiang University, Harbin 150500, China; 3. School of Chemical Eng ineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

Lactobacillus paracasei HD1.7, isolated from spent brine from pickled Chinese cabbage, was used as a starter culture to establish and investigate a microbial ecosystem model for pickled Chinese cabbage fermentation, i.e., HD1.7 fermentation in comparison with natural fermentation as control. High performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) were adopted to detect organic acid, acidity, nitrite, VC, glycerol, ethanol, mannitol, 2,3-butanedilol and volatile flav or compounds in the model and control groups and eight commercial products. It was found that the org anic acid content and acidity were positively correlated in all samples. The organic acids contents of Heida branded pickled Chinese cabbage, HD1.7 fermented Chinese cabbage and Yuanziyuanwei branded pickled Chinese cabbage were (13.21 ± 0.13), (13.20 ± 0.17) and (13.13 ± 0.13) g/L, respectively, which were higher than those of other samples. Furthermore, Heida branded pickled Chinese cabbage, HD1.7 fermented Chinese cabbage and Bianfuji branded pickled Chinese cabbage showed a significantly lower nitrite concentration and a significantly higher VC concentration (P ＜ 0.05) and therefore had better safety and nutritional value than did othe r samples in addition to higher conten ts of flavor compounds and better sensory quality. In conclusion, these results may help to monitor the production process of pickled Chinese cabbage and establish quality standard for pickled Chinese cabbage and they are of great practical significance to enhance the quality stability of pickled Chinese cabbage and the level of industrial development.In addition, these results also indicate the promising application potential of L. paracasei HD1.7 as a starter culture in industrial production of pickled Chinese cabbage.

2016-06-29

國家自然科學基金青年科學基金項目（31300355）；哈爾濱市科技局青年后備人才項目（2014RFQXJ101）；黑龍江省政府博士后項目（LBH-Z15214）；黑龍江大學杰出青年基金項目（JCL201305）

趙丹（1980—），女，副教授，博士，研究方向為微生物生態學及代謝組學。E-mail：zhaodan4u@163.com

*通信作者：葛菁萍（1972—），女，教授，博士，研究方向為微生物生態學及微生物遺傳育種。E-mail：gejingping@126.com

10.7506/spkx1002-6630-201710002

TS201.3

A

1002-6630（2017）10-0006-06

趙丹, 杜仁鵬, 王瑤, 等. 副干酪乳桿菌HD1.7發酵酸菜與商品酸菜代謝物比較與品質評價[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 6-11. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710002. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Dan, DU Renpeng, WANG Yao, et al. Comparative evaluation of metabolite composition and quality of Lactobacillus paracasei HD1.7 fermented and commercial pickled Chinese cabbage[J]. Food Science, 2017, 38(10): 6-11. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710002. http://www.spkx.net.cn