結核分枝桿菌higA基因的擴增及生物信息學分析*

董 娜，劉 丹，付玉榮，伊正君△

(濰坊醫學院:1.醫學檢驗學系；2.臨床學院病原生物學教研室，山東濰坊 261053)

結核分枝桿菌higA基因的擴增及生物信息學分析*

董 娜1，劉 丹1，付玉榮2，伊正君1△

(濰坊醫學院:1.醫學檢驗學系；2.臨床學院病原生物學教研室，山東濰坊 261053)

目的 對結核分枝桿菌的higA基因進行擴增，同時利用生物信息學方法分析其編碼蛋白的結構和功能。方法 從結核分枝桿菌標準株H37Rv基因組DNA中擴增higA基因，對擴增產物進行測序。利用生物信息學網站和軟件分析higA蛋白的理化性質、信號肽、空間結構、抗原表位等。結果 higA基因擴增產物與預期一致，大小為450 bp。higA蛋白共149個氨基酸，理論等電點7.93，脂溶性系數94.30，不穩定系數36.57，預測該蛋白為穩定蛋白。higA蛋白無信號肽，含10個磷酸化位點和多個潛在的抗原表位。結論 成功擴增出結核分枝桿菌higA基因。

分枝桿菌，結核；基因擴增；higA；生物信息學分析

據WHO 2015年結核統計報告顯示， 2014年結核病全球新發病例960萬，150萬死于肺結核，我國新發結核病例93萬人，居世界第33位[1]。目前，結核病的藥物治療主要是針對活動性肺結核，而潛伏性和耐藥性肺結核為結核病治療的兩大難題。因此，深入研究結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)的耐藥性和持留性的機制，發現結核病治療的新靶點，研發新藥，阻止結核病疫情的發展至關重要。研究發現，大量細菌的持留性和耐藥性的產生機制是由于毒素-抗毒素系統(TAS)的激活[2-3]，抗毒素被細胞內Lon和Clp蛋白酶降解或消耗[4]，毒素蛋白釋放出來，干擾或改變細胞三磷酸腺苷(ATP)、細胞壁合成和DNA復制，最終導致細胞死亡或耐藥持久性的形成[5]，毒素還可以中和細菌中質粒的抗性[6]。Kim等[7]和Fineran等[8]等研究發現TAS與細菌生物膜的形成及噬菌體的防御密切相關。致病性的MTB中有88對假定的TAS[9]，而非致病性的恥垢分枝桿菌僅有2對假定的TAS，進一步說明TAS的數量與細菌的致病性相關[10]。

higBA TAS由細菌染色體編碼，屬于Ⅱ型TAS。在對higBA作用機制的研究中發現，higA通過直接抑制 higB P2啟動子表達，進一步控制Rv1954A-Rv1957(Rv1955-higB毒素和Rv1956-higA抗毒素)的表達[11]，刪除higA抗毒素時 higB毒素異常高表達，導致MTB死亡[12]。因此，若能利用higBA系統調控MTB的凋亡，將是結核病治療方面的重大突破。

1 材料與方法

1.1 材料 MTB H37Rv基因組DNA由本實驗室提供。主要試劑：Prime STAR?HS DNA Polymerase、2×GC Buffer、Taq酶、PCR引物均購自山東賽恩斯科技有限公司。DNA Marker購自重慶海韻生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 從GenBank中檢索H37Rv higA的基因編碼序列，用Primer 5.0軟件進行引物設計。上游引物P1:5′-GAT GGT ACC ATG AGC ATT GAC TTC CCT-3′；下游引物P2:5′-CTA AAG CTT TCA TGC CAC CTC AAC CTG-3′，引物長度為27 bp。引物由山東賽恩斯科技有限公司合成。

1.2.2 MTB higA基因的PCR擴增 以MTB基因組DNA作為反應模板，P1，P2為引物進行擴增，擴增體系如下：無菌水為17.7 μL，2×GC Buffer為25.0 μL，dNTP為 4.0 μL，P1、P2 各1.0 μL，DNA模板為1.0 μL，Taq酶為0.3 μL，總體積為50.0 μL。擴增條件：共35個循環，其中95.0 ℃預變性3 min；98.0 ℃ 10 s；59.8 ℃ 10 s；72.0 ℃ 45 s；最后72.0 ℃延伸10 min。PCR擴增產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 higA基因的PCR產物序列分析 將經初步鑒定正確的PCR產物送南京巴傲德生物科技有限公司測序，并通過NCBI上的Blast進行比對分析。

1.2.4 higA蛋白的生物信息學分析 利用蛋白質分析系統EXPASYP Proteomic中Protparam程序分析higA蛋白的理化性質，利用protscale、SignaIP 4.1和MotifScan分析higA蛋白的親(疏)水性、信號肽以及翻譯后修飾位點。采用蛋白質分析系統EXPASY proteomic中的GOR4 和SWISS_MODEL 進行蛋白質二級結構的分析和空間構象的模擬。利用Bepipred 1.0b server 和SYFPEITHI軟件預測higA蛋白的抗原表位。

2 結 果

2.1 higA基因的PCR擴增 PCR擴增產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在450 bp處出現特異性條帶，與預期大小一致，見圖1。

M：DNA-相對分子質量標準(DL2000)；1：higA基因PCR產物。

圖1 higA基因的PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2.2 higA蛋白的生物信息學分析

2.2.1 higA蛋白的理化性質 該蛋白由149個氨基酸組成，其中Ala(A)丙氨酸17個，占總氨基酸的11.4%，含量最高。分子式為C735H1195N221O219S4，原子總數2 374，相對分子質量16 760.1，理論等電點7.93，脂溶性系數94.30，不穩定系數36.57 ，為穩定性蛋白。當成熟肽末端為甲硫氨酸時，在哺乳動物網織紅細胞體外半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌中的半衰期分別大于20 h和10 h。利用SignaIP 4.1，分析蛋白的氨基酸序列顯示無信號肽。higA蛋白的平均疏水性系數為-0.349 (圖2)，為親水性蛋白。

圖2 higA蛋白的親(疏)水性

2.2.2 higA蛋白的二級結構 應用GOR4進行二級結構預測，α-螺旋(Hh)、β-折疊(Ee)、β-轉角(Tt)和無規則卷曲(Cc)所占比例分別為43.62%、17.45%、4.70%、34.23%，該蛋白無規則卷曲含量高，結構比較松散。

2.2.3 higA蛋白的翻譯后修飾位點 經Motif Scan分析，higA蛋白共有10個翻譯后修飾位點：5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(28-31、52-55、68-71、101-104、117-120)，5個蛋白激酶C磷酸化位點(24-26、101-103、113-115、117-119、142-144)。

2.2.4 33級結構利用蛋白質分析系統EXPAY proteomic (http://expasy.org/tools/#pattern )43級結構模型組裝軟件SWISS-MODEL模擬higA的三級結構,結構見圖3。

圖3 higA蛋白的同源模建空間結構

2.2.5 抗原表位的預測 利用Bepipred 1.0b server 軟件預測higA蛋白質有1個潛在的B細胞抗原表位,位置在1aa-9aa。應用SYFPEITHI在線程序預測higA共含有10個CTL細胞表位見表1；6個Th細胞表位見表2。

表1 SYFPEITHI預測higA的限制性CTL表位

表2 SYFPEITHI預測higA的輔助性T細胞表位

3 討 論

TAS最早是在1983年由Ogura和Hiraga作為質粒的穩定系統而發現的。TAS共5種類型，其中Ⅱ型TAS由染色體或質粒編碼，共9個家族(ccd AB、maz EF、vap BC、phd/doc、par DE、hig BA、rel BE、 hip B和hic AB)，通過蛋白復合物抑制毒素蛋白的活性[8]，與細菌壓力狀態下的存活狀態、耐藥性和持留性密切相關[13]。因此，可通過TAS來解決臨床上耐藥和持留菌的治療問題。

近年來，隨著基因組學和蛋白質組數據庫的不斷擴大，生物信息學方法在微生物致病性研究中的應用越來越廣泛，在疾病防治中發揮重大作用[14-15]。本研究從MTB基因組中成功克隆出higA基因，并運用生物信息學方法對higA蛋白的理化性質、結構和功能進行分析，發現該蛋白共149個氨基酸，理論等電點 7.93，屬于穩定性蛋白質，呈疏水性。β轉角和無規則卷曲位于蛋白表面，有利于抗體嵌合，常含有優勢抗原表位[16]。higA蛋白中β轉角和無規則卷曲含量高，提示其容易與抗體嵌合，可能含有潛在的抗原表位。higA蛋白的空間構象能夠直觀的展示蛋白質的立體構象，對進一步研究其結構與功能的關系等具有重大意義。綜上所述，本研究初步認識了higA蛋白的基本結構和功能，為進一步研究higA蛋白在結核病治療的應用價值方面提供了更多的理論依據。

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Analysis of amplification and bioinformatics on mycobacterium tuberculosis protein higA*

DongNa1,LiuDan1,FuYurong2,YiZhengjun1△

(1.DepartmentofMedicalLaboratory；2.DepartmentofPathogenBiology,WeifangMedicalUniversity，Weifang，Shandong261053,China)

Objective To amplify the higA gene from the Mycobacterium tuberculosis,and to analyze the structure and function of their encoded proteins by using bioinformatics.Methods Total DNA was extracted from Mycobacterium tuberculosis.PCR of higA was performed and the products were sequenced.The biological features of the higA protein including，its physical and chemical properties,signal peptide,spatial structure and epitopes were analyzed by using software online.Results The PCR products of higA were 450 bp in length，which were consistent with the expected size.The higA protein consisted of 149 amino acids and had the following characteristics:a theoretical isoelectric point of 7.93，a fat-soluble factor of 94.30，and instability coefficient of 36.57.The higA protein had no signal peptide,containing 10 phosphorylation sites and multiple potential epitopes.Conclusion Mycobacterium tuberculosis higA gene can be amplified by PCR and the characteristics of higA protein is identified.

mycobacterium tuberculosis；gene amplification；higA；bioinformatics analysis

物信息學·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.024

國家自然科學基金資助項目(81470001，81170080)。 作者簡介： 董娜(1990-)，在讀碩士，主要從事分子診斷方面研究。△

，E-mail:fuyizhengjun@163.com。

R378.91

A

1671-8348(2017)14-1944-03

2016-11-20

2017-01-06)