人心房肌細胞分離方法的改良研究*

王笑宇，范忠才，周 偉，余奕言，周 濤，李妙齡△

(1.西南醫科大學附屬醫院心內科，四川瀘州 646000；2.西南醫科大學心血管醫學研究所，四川瀘州 646000)

人心房肌細胞分離方法的改良研究*

王笑宇1，范忠才1，周 偉1，余奕言2，周 濤1，李妙齡2△

(1.西南醫科大學附屬醫院心內科，四川瀘州 646000；2.西南醫科大學心血管醫學研究所，四川瀘州 646000)

目的 探索改良的人心房肌細胞分離方法。方法 采用兩步酶消化法急性分離人心房肌細胞，采用膜片鉗全細胞記錄技術記錄小電導鈣激活鉀通道。結果 該分離方法可獲得數量較多的心房肌細胞，竇性心律患者可獲得完整有橫紋細胞320±30，慢性房顫患者可獲得完整有橫紋細胞230±20，比較差異有統計學意義(P<0.01)。該方法可獲得大量形態完整，橫紋清晰的單個人心房肌細胞，且能在所分離的心房肌細胞上記錄到典型的小電導鈣激活鉀通道電流。結論 該試驗所采用的分離方法簡便，穩定有效，可獲得細胞數量多和細胞質量好的單個人心房肌細胞。

電學；肌細胞，心臟；人心房??；分離方法；膜片鉗；離子通道

采用單個心肌細胞進行心律失常發病機制的研究及抗心律失常藥物靶點的篩選，是目前研究的熱點。這些研究均需要以單個心肌細胞為研究對象，通過膜片鉗技術檢測離子通道的電流變化來闡明和證實。細胞活性正常是上述研究的根本。因此，分離的心肌細胞質量好是上述研究成功的重要保證。人體標本來源珍貴，探索完善的人心房肌細胞分離方法至關重要。隨著電生理研究技術的深入進展，國內外的學者都對人心房肌細胞分離方法作了相應的報道，分離方法不斷改善[1-6]，但在實際操作中分離出符合試驗要求的細胞卻并非易事?，F多采用兩步酶解法分離心肌細胞，但液體pH值、酶濃度、消化時間等報道不一，獲得的心肌細胞質量也有所差異。本實驗室從事心房顫動電生理研究多年，對心肌細胞分離方法掌握熟練。經過理論和實踐相結合，能夠優化出一種更為有效的適合做膜片鉗試驗的細胞，并在單個心房肌細胞上可觀察到功能正常的小電導鈣激活鉀通道電流(small-conductance calcium-activated potassium channels,ISK)，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 選取2015年6月至2016年6月在西南醫科大學附屬醫院接受體外循環手術患者的新鮮右心耳組織。其中，竇性心律(SR)患者15例，慢性房顫(AF)患者13例。所有受試者均簽署知情同意書，術前均行常規超聲心動圖檢查。取材獲得西南醫科大學附屬醫院倫理委員會同意，所有試驗程序遵照國內相關法規和政策。

1.1.2 主要試劑 V型膠原酶、XXIV型膠原酶、牛血清清蛋白、4-羥乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)、乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、牛磺酸、腺苷、甘露醇、β-羧基丁酸、SK通道特異性阻斷劑(apamin)均為Sigma公司產品，試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要溶液 試驗中所用細胞分離液，包括(1)心肌轉運液(牛黃酸 10 mmol/L,腺苷 5 mmol/L,硫酸鎂8 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,磷酸二氫鉀50 mmol/L,甘露醇100 mmol/L,葡萄糖140 mmol/L,用氫氧化鉀調pH值至 7.4)；(2)介質液(氯化鈉 137 mmol/L,?；撬?10 mmol/L,硫酸鎂 1 mmol/L,磷酸二氫鉀 5 mmol/L,HEPES 5 mmol/L,葡萄糖 10 mmol/L,用氫氧化鉀調pH值至 7.4)；(3)心肌細胞KB液 (?；撬?0 mmol/L,β-羧基丁酸10 mmol/L,磷酸二氫鉀10 mmol/L,氯化鉀 20 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EGTA 10 mmol/L,甘露醇5 mmol/L,葡萄糖 25 mmol/L,谷氨酸鉀 70 mmol/L,清蛋白 1 mg/mL,用氫氧化鉀調pH值至 7.4)；(4)記錄離子通道的浴液(N甲基氨基葡萄糖 140 mmol/L,氯化鉀 4 mmol/L,氯化鎂 1 mmol/L,葡萄糖 5 mmol/L,HEPES 10 mmol/L，用鹽酸調pH值至 7.4)；(5)電極液 (葡萄酸鉀144 mmol/L,氯化鎂 1.55 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EGTA 5 mmol/L)。

1.2 方法

1.2.1 人體心房肌細胞的分離

1.2.1.1 準備工作 (1)打開水浴箱，保證水浴箱的溫度恒定為37 ℃左右；(2)制備酶液Ⅰ(蛋白酶5～6 U/mL，膠原酶150 U/mL，牛血清清蛋白1 mg/mL，總量5 mL，用酶介質液配制),制備酶液Ⅱ(膠原酶150 U/mL，清蛋白1 mg/mL，總量20 mL，用酶介質液配制)分裝于4個玻璃小瓶中(室溫)；(3)心肌轉運液充氧約20 min，充氧飽和后轉移入20 mL玻璃小瓶后置于冰桶中送往手術室，剩余心肌轉運液放置于4 ℃以備后續洗滌組織塊用。

1.2.1.2 轉運組織 參考李妙齡等[1]的方法并加以改進，將體外循環手術中切除的右心耳組織置于充氧飽和冰冷的心肌轉運液中。轉運至實驗室應該越快越好,不超過10 min為佳。如果轉運過程不可避免時間延長，那么保存液的溫度應維持在4 ℃[2]。

1.2.1.3 洗滌組織 (1)將組織與心肌轉運液置入10 cm直徑的培養皿中，洗滌血液和油脂，剔除心肌組織外膜及脂肪組織；(2)200～600 mg組織足夠用于分離細胞[2]；(3)在4 ℃心肌轉運液中將組織剪成1 mm3左右的小塊。(4)整個過程保證持續充氧，不超過3 min。

1.2.1.4 消化組織 分兩步組成：(1)將剪碎的組織塊置于酶液Ⅰ中進行消化，整個酶消化過程均要處于水浴箱內(37 ℃左右)。若室溫較低可能影響酶消化細胞，因而保持較高室溫。整個過程持續充氧。一般需要消化30～50 min，消化時間因酶量、組織塊大小、組織性質、溫度而不同。一般在20 min左右用巴氏吸管吸取酶液于倒置相差顯微鏡下觀察，出現單個有橫紋心肌細胞時，可終止酶液Ⅰ消化。向酶液Ⅰ中加入酶介質液，吹打洗滌后去除上清液，重復該步驟1～2次。(2)將組織塊置于酶液Ⅱ中消化，保持37 ℃并持續充氧，這一過程氧氣保持低速、平穩，不宜充氧過快，避免氣流損傷細胞。消化3～4 min有細胞出現，一般在5～8 min時出現大量細胞，低倍視野(×100)下約10個細胞，且細胞橫紋清楚，可終止酶消化。消化時間依情況而定，一般不超過10 min。在有細胞的前提下，消化時間寧短勿長，時間過長細胞易受損，不適合膜片鉗試驗。酶液Ⅱ消化后，用酶介質液洗滌輕柔吹打，收集上清液，將組織塊再轉移至酶液Ⅱ。酶液Ⅱ消化重復3次，且消化時間越來越短。

1.2.1.5 保存細胞 3次消化收集的酶液500 r/min離心5 min后去除上清液，加入KB液于4 ℃保存備用， 1 h后可用于電生理試驗。

1.2.1.6 心肌細胞的計數 選取SR組心房肌8例和AF組心房肌8例進行細胞計數，吸取相同體積的KB液的細胞懸液于倒置相差顯微鏡下，每組獲得的心房肌細胞在低倍鏡下(×100)觀察并計數。

1.2.1.7 心肌細胞形態的鑒定 在細胞計數的同時，按細胞形態分為桿狀有橫紋的細胞，橫紋不清晰細胞及收縮成團的細胞。

1.2.1.8 心肌細胞的活力檢測 采用臺盼藍染色方法鑒定心肌細胞的活力，試驗中應用0.5 mL心房肌細胞懸液加入0.5 mL的臺盼藍溶液,充分混勻后在室溫下靜置5 min后用吸管吸取少量細胞懸液,注入計數板小室內。在倒置相差顯微鏡下觀察心房肌細胞核染色情況。如細胞核未被染色,提示心肌細胞存活；如細胞核被染成藍色,提示心肌細胞死亡。用SR組4例和AF組4例測定的平均值計算細胞存活率,心房肌細胞活力(%) =(細胞總數-著色細胞數)/細胞總數×100 %。

1.2.2 電生理記錄 吸取細胞懸液靜置于浴槽中，10 min后待細胞貼壁后加全細胞浴液灌流5～10 min。于倒置相差顯微鏡下尋找呈桿狀、細胞膜完整、橫紋清楚、無收縮、貼壁良好的心房肌細胞進行電生理試驗。試驗電極采用軟質玻璃管，經橫式拉制儀(P-97，shutter公司,美國)拉制而成。充灌電極液后電極阻抗2～5 MΩ。采用膜片鉗放大器(EPC 10.0，HEKA公司，德國)記錄電流信號，用Patch master軟件采集數據存儲于計算機中。采樣頻率為10 kHz，低通濾波頻率為2 kHz。

2 結 果

2.1 人心房肌細胞的計數 從心臟外科體外循環所取的心房肌組織約70～90 mg，SR組可獲得完整有橫紋細胞320±30，AF組可獲得完整有橫紋細胞230±20，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，均適合于做膜片鉗試驗，見圖1。

2.2 心肌細胞活力的鑒定 SR組與AF組分離的心房肌細胞，分別為(74.5±4.9)%和(71.9±3.7)%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

A:兩組分離獲得的細胞數；B:兩組分離的細胞的存活率。

圖1 兩組分離的細胞數和細胞存活率比較

2.3 心肌細胞形態的鑒定 該方法分離的細胞多呈桿狀，有分支，兩端鈍圓，橫紋清晰。細胞直徑10～30 μm，細胞長度約50～120 μm。分離的細胞按形態可分為以下幾類：第1類，細胞膜光滑完整，折光性強，橫紋清楚，無收縮，是試驗首選，該類細胞占60%～70%；第2類，細胞膜光滑，折光性好，有橫紋，不收縮，但細胞表面有1處或多處凹陷，這類細胞也能封接并記錄電流，占10%；第3類，細胞膜不光滑，細胞不完整有破損，折光性差，無橫紋，易收縮，占5%～10%；第4類，另有細胞收縮成團，約占10%。后兩類細胞不符合試驗要求。4 ℃低溫保存的細胞可存活大于12 h，具有正常的細胞電生理特性。從SR組和AF組心房組織分離獲得的單個心房肌細胞，SR組細胞橫紋清晰，折光性好，AF組細胞的橫紋欠清晰，見圖2。

A:SR組;B：AF組。

圖2 急性分離的人心房肌細胞(×400)

2.4 急性分離人心房肌細胞記錄的小電導鈣激活鉀通道電流 本試驗中電極內液的游離鈣離子濃度為5×10-7mol/L，保證SK通道的激活。形成全細胞模式后，保持電位在-60 mV，指令電壓從-130 mV去極化到+60 mV，持續200 ms，階躍10 mV，可記錄到一內向整流電流,在此基礎上加入SK通道特異性阻斷劑apamin后電流明顯減小，加藥前后相減的電流為SK通道電流。當指令電壓在-130 mV時的電流幅值為-434 pA，加入Apamin后電流幅值為-270 pA，-130 mV的SK通道電流為-164 pA。給藥前后的電流-電壓關系曲線見圖3，該電流具有明顯的內向整流特性。

A：加apamin前;B:加apamin(100 nmol/L)后;C:SK通道的電流-電壓關系曲線。

圖3 人心房肌細胞上記錄到的小電導鈣激活鉀通道

3 討 論

采用人體心房樣本進行試驗具有較好的臨床價值。人心房肌細胞的分離雖有較多的報道，但真正獲得質量好活性正常的人心房肌細胞依然很有難度，因此獲得功能正常的人心房肌細胞成為了后續很多試驗的瓶頸。本文研究者從事心房肌細胞研究二十余年，通過該分離方法的改進，可以獲得質量好，數量多的單個人心房肌細胞。分離細胞經常會遇到以下問題：細胞形態好，但耐鈣能力差，在含鈣的細胞外液中收縮死亡；耐鈣但貼壁不良好，無法滿足試驗要求。

以上現象都與細胞質量不良和功能受損密切相關，本文提出的分離方法借鑒國內外科研者分離方法，依靠大量實踐，從以下幾方面嚴格控制條件[7]：(1)整個試驗過程均需要氧飽和，轉運組織至實驗室這一過程由于無法充氧，要保證心肌轉運液充氧充足；酶解細胞過程需維持在37 ℃；嚴格控制細胞分離液的pH值，分離液pH控制在7.2～7.4[8]；本試驗采用德國產的純水儀(Millipore),符合試驗要求：水電導在1 μs/cm以下。(2)分離時應盡量剔除結締組織和脂肪組織，實踐表明油脂和結締組織影響酶解細胞的效果。組織塊以1 mm3左右大小較佳，太大不利于酶消化。(3)酶濃度、類型、批次、保存溫度、溶解程度都與分離效果有關[9-10]。根據不同年齡段的患者酶量作適當調整，調整幅度不超過10%。一般中老年患者酶量高于青年及幼兒患者。膠原酶的選擇可能是分離細胞最關鍵的一步了。Worthington V型膠原酶已經成功分離出人心房肌細胞[11-17]。盡管Ⅱ性膠原酶也能分離出大量有活性符合試驗要求的細胞，但根據實踐還是推薦V型。即使在一個單一的膠原酶類型中也有不同批次表現出的顯著酶活性不同。這些不同就要求研究者仔細挑選批次并測試不同批次以獲得完美的分離過程。Worthington生化公司有在線可用的批次挑選工具。(http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php)[18]。(4)嚴格控制消化時間，消化時間因酶量、組織塊大小、患者年齡、溫度有所不同。酶解過程中可能轉瞬就會出現細胞，特別是酶液Ⅱ消化過程，出現大量細胞應立即中止，避免過度消化而致細胞狀態不好。(5)吹打細胞應輕柔，特別是酶液Ⅱ消化階段和離心后，盡量保持細胞的完整性。(6)早在1970年就已經發現肌細胞在含鈣環境中分解，所有的細胞會攣縮或沒有活性。因此分離細胞要在無鈣中完成。但是生理濃度的鈣離子重新引入會引起鈣快速內流而致細胞死亡。這被稱為“鈣離子悖論現象”。改善分離環境包括通過添加?；撬峤档蚿H到7.0，，還有將分離的細胞保存在配有EGTA的保存液中，這些都可以防止上述現象發生。

本試驗參考李妙齡等[1]的方法，進行了改進。本方法的優點在于省略了EGTA脫鈣的過程，也不需要過濾。酶用量少，對細胞損傷小。每次用蛋白酶2.5 mg，膠原酶4.5 mg。消化時間縮短，一般酶液Ⅰ消化30～40 min，酶液Ⅱ不超過10 min。酶液Ⅰ出現有橫紋細胞就終止消化，保證了細胞的質量，這是實踐總結。分離出的細胞有收縮成團的，但60%～70%符合試驗要求，在含鈣細胞外液中能夠存活，可保存12 h左右。

細胞的完整性和正常的生理功能是試驗的基礎，應用該方法分離出的細胞可封接并且能記錄到ISK電流，表明這種方法是能分離出符合膜片鉗要求的細胞，具有可重復性，有利于心肌細胞相關疾病的電生理試驗研究。

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An improved method for isolation of human atrial cardiomyocytes*

WangXiaoyu1,FanZhongcai1,ZhouWei1，YuYiyan2,ZhouTao1，LiMiaoling2△

(1.DepartmentofCardiology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China; 2.KeyLaboratoryofMedicalElectrophysiology,MinistryofEducationofChina,InstituteofCardiovascularResearch,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000，China)

Objective To study an improved isolated method of single human atrial myocytes.Methods Enzyme digestion method was used to isolate single myocytes from human atrial and whole-cell patch clamp technique was used to record small conductance calcium activated potassium current.Results This method obtained a large number of atrial myocytes.The total amount of atrial myocytes in SR group was 320±30 while AF group was 230±20 and the difference was statistically significant(P<0.01).In this study,a large number of simple and striated single atrial myocytes were obtained，and a typical small-conductance calcium-activated potassium channel current was recorded on the isolated atrial myocytes.Conclusion The established isolated method is simple,stable and effective.We can acquire a large amount of single atrial myocytes with good quality.

electricity;myocytes,cardiac;human atria myocytes；isolated method;patch-clamp technique;ionic channel

術與方法·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.023

國家自然科學基金資助項目(81470022);四川省教育廳重點項目(16ZA0192)；瀘州市-瀘州醫學院聯合項目(20140975)。 作者簡介：王笑宇(1990-)，在讀碩士，主要從事心血管內科方面研究?！?/p>

，E-mail:limiaolingcc@163.com。

R972.4

A

1671-8348(2017)14-1941-03

2017-02-08

2017-03-26)