miR-204對乳腺癌MDA-MB-231細胞生物學特性的影響*

吳劉成，杜利莉，王 靜，殷海琳，馬 超，蔣茂榮，邵義祥△

(1 南通大學杏林學院，江蘇南通 226009；2 南通大學實驗動物中心，江蘇南通 226001)

miR-204對乳腺癌MDA-MB-231細胞生物學特性的影響*

吳劉成1，2，杜利莉1，王 靜1，殷海琳1，馬 超1，蔣茂榮2，邵義祥2△

(1 南通大學杏林學院，江蘇南通 226009；2 南通大學實驗動物中心，江蘇南通 226001)

目的 研究microRNA-204(miR-204)對乳腺癌細胞生物學特性的影響。方法 在人乳腺癌細胞MDA-MB-231中轉染miR-204模擬物和抑制劑后48 h，實時熒光PCR(Real-time PCR)檢測細胞中miR-204表達變化。流式細胞儀分析miR-204對MDA-MB-231細胞增殖、凋亡的影響。采用Transwell遷移小室分析法檢測miR-204對MDA-MB-231細胞遷移的影響。結果 實時熒光PCR分析：miR-204模擬物和抑制劑效果顯著，與正常對照比較差異有統計學意義(P<0.01)；流式細胞儀分析：與正常對照相比，miR-204 模擬物組G1期細胞數目明顯減少(P<0.01)，G2/M期細胞數目明顯增多(P<0.01)，而miR-204 抑制劑的作用則相反，G1期細胞數目明顯增多(P<0.01)，G2/M期細胞數目明顯減少(P<0.01)；miR-204模擬物組明顯促進細胞凋亡(P<0.01)，而抑制劑組明顯抑制細胞凋亡(P<0.01)。Transwell遷移小室分析：miR-204 模擬物組穿過Transwell遷移小室的細胞明顯減少(P<0.01)，而抑制劑組則相反，細胞數目明顯增多(P<0.01)。結論 miR-204對乳腺癌MDA-MB-231細胞具有負調控作用，能夠抑制乳腺癌細胞增殖和遷移，促進癌細胞凋亡。

乳腺腫瘤；細胞凋亡；微RNAs；miR-204；MDA-MB-231；細胞生物學特性

乳腺癌是嚴重危害生命健康的惡性腫瘤之一，是女性第2位最常見的惡性腫瘤[1]，且乳腺癌的發病率和病死率呈逐年增長趨勢[2]。目前，已經有開發相關的靶向藥物用于臨床治療，但療效并不樂觀，分子靶向治療被認為是一種有效途徑[3]。微小RNA(miRNA)的出現為研究乳腺癌的發病機制提供了新的策略和思路。有研究發現miRNA-204(miR-204)過表達則可抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移能力[4]。顯然miR-204對腫瘤細胞具有抑制作用，而在乳腺癌中研究的還比較少。因此，本試驗構建miR-204的模擬物及抑制劑，并轉染作用于乳腺癌MDA-MB-231細胞，研究對該細胞的行為學變化，以期為乳腺癌的靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 使用人乳腺癌MDA-MB-231細胞系，由南通大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要儀器與試劑 CO2培養箱(Thermo公司，美國)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司，中國)；倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；流式細胞儀(BD公司，美國)；ABI stepone 實時熒光PCR (Real-Time PCR) System (ABI公司，美國)；低溫冷凍離心機 (Eppendorf公司，德國)。1640培養基，胎牛血清(HyClone公司，美國)；Trizol (Invitrogen公司，美國)；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒，Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(碧云天生物科技公司，中國)；riboFECTTMCP 轉染試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司，中國)；SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR(Roch公司，瑞士)；Omniscript?Reverse Transcription kit (Qiagen公司，德國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇及培養 按照常規的細胞凍融方法操作，以緩凍速溶為原則，將凍存細胞從-80 ℃冰箱中取出，迅速放入37 ℃的水浴，使其快速融化，之后加入完全培養基。放入CO2培養箱，第2天更換培養基，每隔1～2天或者培養基變為黃色時更換培養基。

1.2.2 miR-204轉染細胞方法 轉染前1 d細胞接種至6孔板中，密度為1×105，采用含有10%胎牛血清(FBS)的1640培養基培養細胞，使轉染時的細胞密度能夠達到50%～80%。細胞轉染按照riboFECTTMCP 轉染試劑盒說明書進行操作。試驗設置4個組：正常對照組加入500 μL的磷酸鹽緩沖液(PBS)；陰性對照組加入陰性對照mimic及riboFECTTMCP Reagent；抑制劑組加入miR-204抑制劑及riboFECTTMCP Reagent；模擬物組加入miR-204 mimic及riboFECTTMCP Reagent。之后將6孔板放入CO2培養箱中培養48 h。

1.2.3 Real-time PCR檢測miR-204表達水平 本試驗檢測miR-204采用U6作為內參，其中RT反應中的頸環引物和Real-time PCR反應中的頸環引物，均由廣州銳博生物有限公司設計并合成。細胞總RNA提取。轉染48 h，然后棄掉培養基，使用預冷PBS緩沖液洗2次；6孔板中加入1.0 mL Trizol，水平放置片刻；用槍頭吹打幾次，轉入1.5 mL EP管中，反復吹打至無明顯沉淀；室溫孵育5 min；加入0.2 mL三氯甲烷；渦旋振蕩器上震蕩15 s；室溫孵育5 min；4 ℃,12 000 r/min,15 min；吸取大約0.5 mL上清液；加入0.5 mL異丙醇，上下顛倒混勻；室溫孵育10 min；4 ℃，12 000 r/min，10 min；棄去上清液；加入1.0 mL 75%乙醇；輕微混勻，4 ℃,7 500g,5 min，棄去上清液；重復上一步驟；靜置5～10 min，晾干；用RNase-free水重懸；55～60 ℃水浴10～15 min，超微量分光光度計測定核酸濃度。PCR反應體系及條件：RNA template (2 μg),Bulge-LoopTMmiRNA RT Primer(62.5 nmol/L) 2.0 μL，加RNase-free water至14 μL,以上體系混勻后，瞬時離心，70 ℃放置10 min后，再加入以下試劑進行RT反應，10×Buffer RT 2 μL，dNTP Mix (5 mmol/L each dNTP) 2 μL，RNase 抑制劑 (10 U/μL) 1 μL，Omniscript Reverse Transcriptase 1 μL，total reaction volume 20 μL，瞬時離心，37 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，于-20 ℃保存。Real-time PCR反應體系及條件。20 μL 反應體系：2×SYBGreen Master Mix 10 μL，Bulge-LoopTMmiRNA Forward Primer (5 μmol/L) 2 μL，Bulge-LoopTMmiRNA Reverse Primer (5 μmol/L) 2 μL，cDNA 2 μL,加ddH2O 至20 μL。試劑混勻后短暫離心置于ABI stepone Real-time PCR 儀，程序如下：95 ℃ 5 min；(95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s收集熒光)×45；55.0～90.0 ℃每上升0.3 ℃讀熒光值生成熔解曲線。每個PCR反應設置3個復孔，擴增結束后，根據擴增曲線和熔解曲線分析擴增效率和特異性，并得到各反應管的循環閾值(Ct)，miR-204的相對表達量采用2-△△Ct方程進行計算。

1.2.4 細胞增殖和凋亡檢測方法 分別在6孔板中轉染試劑48 h后，按照碧云天生物科技公司試劑盒說明書操作，并用流式細胞儀檢測。

1.2.5 細胞遷移檢測方法 在6孔板中細胞轉染試劑48 h后，更換為基礎培養基，饑餓24 h，收集細胞，PBS洗滌再重懸，向Transwell上室中加入200 μL細胞懸液(2×105)，下室中加入500 μL完全培養基，參照文獻[5]操作。

2 結 果

2.1 miR-204 抑制劑和模擬物轉染效率的檢測 4組轉染效率比較差異有統計學意義(F=198.9，P=0.000)。與正常對照組相比，陰性對照組miR-204表達水平率略有上升，但比較差異無統計學意義(t=2.637，P=0.062)；抑制劑組miR-204水平明顯下降(t=11.60，P=0.000)；模擬物組miR-204水平明顯上升(t=14.10，P=0.0000)，見圖1。

圖1 4組miR-204表達水平

A:正常對照組；B:陰性對照組；C:抑制劑組；D:模擬物組。

圖2 細胞流式術檢測各組人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖

2.2 細胞流式術檢測人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖 G1期、S期及G2/M期，3個時期中的4組百分比細胞計數的均數差異有統計學意義(FG1期=106.98，FS期=25.80，FG2/M期=28.24，P<0.01)。G1期：與正常對照組相比，陰性對照組細胞數目增多，但比較差異無統計學意義(P>0.05)，抑制劑組細胞數目明顯增多(P<0.01)，模擬物組細胞數目明顯減少(P<0.01)。S期：與正常對照組相比，陰性對照組細胞數目減少，但比較差異無統計學意義(P>0.05)，抑制劑組細胞數目明顯減少(P<0.01)，模擬物組細胞數目略有增多，但比較差異無統計學意義(P>0.05)。G2/M期：與正常對照組相比，陰性對照組細胞數目增多，但比較差異無統計學意義(P>0.05)，抑制劑組細胞數目明顯減少(P<0.01)，模擬物組細胞數目明顯增多(P<0.01)，見圖2、3。

圖3 miR-204對各組人乳腺癌MDA-MB-231細胞周期的影響

2.3 細胞流式術檢測人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡 4組百分比細胞凋亡計數的均數比較差異有統計學意義(F=118.3，P<0.01)。與正常對照組相比，陰性對照組細胞凋亡數目減少，但比較差異無統計學意義(t=2.267，P=0.086),抑制劑組細胞凋亡數目明顯減少(t=12.77，P<0.01)，模擬物組細胞凋亡數目明顯增多(t=7.086，P<0.01)，見圖4、5。

A:正常對照組；B：陰性對照組；C：抑制劑組；D：模擬物組。

圖4 細胞流式術檢測各組人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡

圖5 miR-204 對各組人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響

2.4 Transwell小室試驗檢測人乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移能力 4組遷移細胞數目的均數比較差異有統計學意義(F=60.77，P<0.01)。與正常對照組相比，陰性對照組細胞遷移數目增多，但比較差異無統計學意義(t=1.011，P=0.369)，抑制劑組細胞遷移數目增多(t=6.411，P<0.01)，模擬物組細胞遷移數目減少(t=7.115，P<0.01)，見圖6、7。

A:正常對照組；B：陰性對照組；C：抑制劑組；D：模擬物組。

圖6 Transwell小室檢測各組人乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移

圖7 miR-204 對各組人乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移的影響

3 討 論

miRNA是一種非編碼小RNA分子(約含22個核苷酸)，存在于植物、動物和一些病毒中，功能主要是RNA沉默和轉錄后修飾調控基因表達[6]。成熟的miRNA是RNA誘導沉默復合體(RISC)的重要組成部分，該沉默復合體還包括核糖核酸酶和許多相關的蛋白質[7]。miR-204定位于人類第9號染色體73424891和73425000位之間。有研究表明miR-204在腫瘤組織中存在異常表達，并與腫瘤增殖[8]、侵襲轉移[9]、化療抵抗[10]及不良預后[11]密切相關。然而，miR-204在不同的腫瘤中起著不同的作用。比如，miR-204在急性淋巴白血病[12]和前列腺癌[13]腫瘤中高表達，起癌基因作用，促進腫瘤的增殖和轉移。而在鼻咽癌[9]和子宮內膜癌[10]等腫瘤中表達下調，起抑癌基因作用，抑制腫瘤的發展。

本研究結果顯示，miR-204促進乳腺癌細胞凋亡，與Wang 等[14]報道的結果一致，抑制細胞的增殖，這與Xiong等[15]報道的結果相似，抑制細胞的遷移能力，這與Imam等[16]等報道的結果相似。研究結果提示，miR-204在乳腺癌細胞中起抑癌基因的作用，能夠抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移并促進其凋亡，具有作為診治乳腺癌分子靶標的潛能。但是miR-204調控乳腺癌增殖和轉移的具體機制還不是很清楚，還有待于更進一步的研究。總之，miR-204可能在乳腺癌的發生、發展及治療過程中發揮重要作用，靶向miR-204治療也可能為乳腺癌的治療提供新思路。

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Effect of miR-204 in cell biological characteristics of breast cancer MDA-MB-231 cell*

WuLiucheng1，2，DuLili1，WangJing1，YinHailin1，MaChao1，JiangMaorong2，ShaoYixiang2△

(1.XinglinCollege，NantongUniversity，Nantong，Jiangsu226009，China；2.LaboratoryAnimalsCentre，NantongUniversity，Nantong，Jiangsu226001，China)

Objective To study the effect of microRNA-204 (miR-204) on the biological characteristics of breast cancer cells.Methods Real-time PCR was used to detect the expression of miR-204 in human breast cancer cell MDA-MB-231 after transfection of miR-204 mimics and inhibitor for 48 h.Flow cytometry was used to analyse the effect of miR-204 on the proliferation and apoptosis of MDA-MB-231 cells.The effect of miR-204 on the migration of MDA-MB-231 cells was detected by Transwell migration assay.Results Real-time PCR analysis showed that miR-204 mimics and inhibitors had significant effect compared with normal control group(P<0.01).Flow cytometry analysis showed that compared with normal control group，the number of G1phase cells of miR-204 mimics group was significantly decreased(P<0.01),while the number of G2/M cells of miR-204 mimics group was significantly increased(P<0.01).In contrast,the number of G1phase cells of miR-204 inhibitor group was significantly increased(P<0.01),while the number of G2/M cells of miR-204 inhibitor group was significantly decreased(P<0.01).miR-204 mimics group significantly promoted apoptosis,while the inhibitor group significantly inhibited apoptosis(P<0.01).Transwell migration analysis showed that the number of cells of miR-204 mimics group were significantly reduced,while the number of cells was significantly increased in the inhibitor group(P<0.01).Conclusion We find miR-204,which can promote cell apoptosis and inhibit cell proliferation and migration,is a negative factor in the breast cancer cell line MDA-MB-231.

breast neoplasms;apoptosis;MicroRNAs;miR-204;MDA-MB-231;cell biological characteristics

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.004

江蘇省高等學校大學生創新創業訓練計劃項目(201513993009Y)。 作者簡介：吳劉成(1980-)，實驗師，碩士，主要從事人類疾病動物模型方面研究。△

，E-mail:shaoyx@ntu.edu.cn。

Q291

A

1671-8348(2017)14-1881-04

2016-11-23

2017-01-11)