TNF-α對鼠根尖乳頭干細(xì)胞增殖及多向分化能力的影響*

曹蓉蓉，馬俊玥，李淑慧，馬 玉，吳佩玲

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，烏魯木齊 830063)

TNF-α對鼠根尖乳頭干細(xì)胞增殖及多向分化能力的影響*

曹蓉蓉，馬俊玥，李淑慧，馬 玉，吳佩玲△

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，烏魯木齊 830063)

目的 研究腫瘤壞死因子-α(TNF-α)對鼠根尖乳頭干細(xì)胞(SCAP)增殖及多向分化能力的影響。方法 采用酶消化法結(jié)合組織塊法獲得SCAP，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(TNF-α濃度為5、10、20、50 ng/mL)和對照組(TNF-α濃度為0 ng/mL)，使用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測SCAP的增殖能力；采用茜素紅染色及實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測TNF-α對SCAP成骨/成牙本質(zhì)能力的影響；油紅O染色檢測TNF-α對SCAP成脂能力的影響；qRT-PCR檢測TNF-α對SCAP血管相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果 體外培養(yǎng)SCAP符合間充質(zhì)干細(xì)胞來源的特征且具有多向分化能力。MTT結(jié)果顯示：與對照組相比，各濃度組均能促進(jìn)SCAP增殖(P<0.05)，其中10 ng/mL TNF-α的促進(jìn)作用最為明顯。茜素紅染色結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組隨著TNF-α濃度的增加，礦化結(jié)節(jié)逐漸變小，形成數(shù)量也逐漸變少。qRT-PCR結(jié)果顯示：3、7 d時(shí)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組骨鈣蛋白(OC)、牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1(DMP-1)表達(dá)量降低，3 d時(shí)兩組OC、DMP-1比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；7 d時(shí)DMP-1比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；14 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組OC、DMP-1表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。油紅O染色結(jié)果顯示：與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組隨著TNF-α濃度的增加，脂滴形成數(shù)量逐漸減少。qRT-PCR結(jié)果顯示：3、7天時(shí)，與對照組相比，血管生成素1、血管內(nèi)皮生長因子A、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 炎性因子TNF-α對SCAP的增殖有明顯促進(jìn)作用但同時(shí)不同程度抑制SCAP多向分化能力。

干細(xì)胞；分生組織；腫瘤壞死因子α；根尖乳頭干細(xì)胞；多向分化；大鼠，Wistar

2006年，Sonoyama等[1]從人未發(fā)育完全的第三磨牙根尖乳頭組織中分離出新的間充質(zhì)干細(xì)胞，命名為根尖乳頭干細(xì)胞(stem cells from apical papilla，SCAP)，并證實(shí)其具有高度的增殖、自我更新和多向分化潛能，并在一定的誘導(dǎo)條件下可向成骨/成牙本質(zhì)、脂肪、軟骨、肌肉、神經(jīng)元等細(xì)胞分化。近年來，隨著人們對SCAP的深入研究，證實(shí)SCAP在介導(dǎo)牙本質(zhì)再生及牙根發(fā)育過程中發(fā)揮著極其重要的作用[2]。牙髓炎、根尖周炎是一種復(fù)雜的炎癥反應(yīng)，其中包含以腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)為主的多種炎性因子，且炎癥的病變程度與炎性因子的水平存在著一定的相關(guān)性[3]。有研究結(jié)果顯示，炎癥微環(huán)境會(huì)影響干細(xì)胞的增殖和分化，甚至引起細(xì)胞凋亡[4]；但對于炎性因子對SCAP分化能力的影響研究甚少。本實(shí)驗(yàn)擬通過不同濃度TNF-α對SCAP進(jìn)行干預(yù)，從而研究炎性因子TNF-α對SCAP增殖及多向分化潛能的影響，為研究炎性環(huán)境下SCAP生物學(xué)特性的改變提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶、谷氨酰胺(Hyclone公司，美國)，Ⅰ型膠原酶(Wor-thington公司，美國)，TNF-α(Peprotech公司，美國)，維生素C、B-甘油磷酸鈉、地塞米松、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBXM)、茜素紅粉劑(Sigma公司，美國)，基質(zhì)細(xì)胞抗原-1(STRO-1，Santa Cruz公司，美國)，兔抗大鼠一抗CD90、CD146(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國)，油紅O染液(南京建成生物工程研究所)，熒光定量PCR試劑盒(Thermo公司，美國)，光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡(萊卡公司，德國)，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)孵箱(力康生物醫(yī)療有限公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國)，Wistar大鼠(新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：IACUC20150423-01)。

1.2 方法

1.2.1 鼠SCAP的培養(yǎng) 健康雄性Wistar大鼠2只，分離根尖乳頭組織，剪碎、消化至絮狀，離心后接種，每2～3天換液，觀察細(xì)胞至80%～90%融合時(shí)，消化，按1∶3常規(guī)傳代培養(yǎng)，取3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞鑒定 免疫熒光法鑒定表面標(biāo)志物STRO-1、CD90、CD146的表達(dá)。多向分化能力的鑒定：茜素紅染色檢測成骨能力；油紅O檢測成脂能力。

1.2.3 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測TNF-α對SCAP增殖能力的影響 取第3代SCAP，以2×103/孔密度接種于96孔板，設(shè)實(shí)驗(yàn)組(TNF-α濃度為5、10、20、50 ng/mL)和對照組(TNF-α濃度為0 ng/mL)，每組3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)1、3、5、7 d，每孔加入5 mg/mL MTT溶液50 μL，37 ℃ 孵育4 h，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，測定各孔490 nm吸光度(A)值并記錄。

1.2.4 檢測成骨/成牙本質(zhì)能力

1.2.4.1 茜素紅染色 取第3代SCAP，以2×104/孔的密度接種于24孔板，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組，24 h后更換含相應(yīng)濃度TNF-α的成骨誘導(dǎo)液，3周后茜素紅染色，觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。

1.2.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá) 取第3代SCAP，以2×105/孔的密度接種于12孔板，設(shè)實(shí)驗(yàn)組(TNF-α濃度為10 ng/mL)和對照組(TNF-α濃度為0 ng/mL)，培養(yǎng)24 h后，更換含相應(yīng)濃度TNF-α的成骨誘導(dǎo)液，分別培養(yǎng)3、7、14 d，按步驟提取RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配成20 μL體系合成cDNA，反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。目的基因骨鈣蛋白(osteocalcin，OC)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1(dentin matrix protein-1，DMP-1)、牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)由華大基因設(shè)計(jì)并合成(表1)。按試劑盒說明書配成25 μL體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)目的基因重復(fù)3管，同時(shí)設(shè)置1管陰性對照，結(jié)果根據(jù)使用倍比關(guān)系2-△△Ct表示，其中ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對照組)。

1.2.5 油紅O檢測SCAP成脂能力 取第3代SCAP，分為實(shí)驗(yàn)組(TNF-α濃度為5、10、20、50 ng/mL)和對照組(TNF-α濃度為0 ng/mL)，培養(yǎng)24 h更換為含相應(yīng)濃度TNF-α的成脂誘導(dǎo)液A，3 d后更換含相應(yīng)濃度TNF-α的成脂液B 24 h，3個(gè)循環(huán)后，油紅O染色，觀察脂滴形成情況并記錄。

1.2.6 qRT-PCR檢測血管相關(guān)基因的表達(dá) 取第3代SCAP，以2×105/孔的密度接種于12孔板，設(shè)實(shí)驗(yàn)組(TNF-α濃度為10 ng/mL)和對照組(TNF-α濃度為0 ng/mL)，培養(yǎng)24 h后，更換含相應(yīng)濃度TNF-α的成骨誘導(dǎo)液，分別培養(yǎng)3、7、14 d，按步驟提取RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配成20 μL 體系合成cDNA，反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。目的基因血管生成素1(angiogenin 1)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor a，VEGFA)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)及內(nèi)參GADPH由華大基因設(shè)計(jì)并合成(表1)。按試劑盒說明書配成25 μL體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)目的基因重復(fù)3管，同時(shí)設(shè)置1管陰性對照，結(jié)果根據(jù)使用倍比關(guān)系2-△△Ct表示，其中ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對照組)。

表1 qRT-PCR目的基因的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 SCAP形態(tài) 原代培養(yǎng)3～5 d后，可見細(xì)胞從組織塊邊緣呈放射狀生長，細(xì)胞形態(tài)多為短梭形，輪廓清楚，大小基本一致，生長狀況良好，可穩(wěn)定傳代，約3～5 d可達(dá)到80%～90%匯合，見圖1。

2.2 細(xì)胞鑒定 SCAP抗STRO-1呈弱陽性表達(dá)，抗CD90、CD146呈陽性表達(dá)。結(jié)果提示符合間充質(zhì)干細(xì)胞來源的特征。茜素紅染色陽性，證實(shí)SCAP具有成骨/成牙本質(zhì)向分化的潛能；油紅O染色陽性，倒置顯微鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)有脂滴形成，證實(shí)SCAP具有成脂向分化的潛能。

2.3 MTT檢測SCAP增殖能力 與對照組相比，各濃度組均能明顯促進(jìn)SCAP增殖，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中10 ng/mL TNF-α的促進(jìn)作用最為明顯，見圖2。

A:CAP原代第3天(×100)；B:第3代SCAP(×100)。

圖1 SCAP生長情況

圖2 不同濃度TNF-α刺激下SCAP的增殖能力

2.4 SCAP成骨/成牙本質(zhì)能力的檢測

2.4.1 茜素紅染色結(jié)果 對照組染色后形成礦化結(jié)節(jié)較大、染色較深；與對照組相比，隨著TNF-α濃度的增加，形成的礦化結(jié)節(jié)逐漸變小，數(shù)量也逐漸減少，見圖3。

2.4.2 qRT-PCR結(jié)果 3、7 d時(shí)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組OC、DSPP、DMP-1表達(dá)量降低。其中，3 d時(shí)兩組OC、DMP-1比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；7 d時(shí)DMP-1比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；14 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組OC、DMP-1表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.5 油紅O染色結(jié)果 對照組染色后可見胞質(zhì)內(nèi)大量紅色大小不等的脂滴形成；與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組隨著TNF-α濃度的增加，脂滴形成數(shù)量逐漸減少，見圖4。

A：對照組；B：實(shí)驗(yàn)組(TNF-α 5 ng/mL)；C：實(shí)驗(yàn)組(TNF-α 10 ng/mL)；D：實(shí)驗(yàn)組(TNF-α 20 ng/mL)；E：實(shí)驗(yàn)組(TNF-α 50 ng/mL)。

圖3 SCAP經(jīng)含不同濃度TNF-α的成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3周染色結(jié)果(×100)

A：對照組；B：實(shí)驗(yàn)組(TNF-α 5 ng/mL)；C：實(shí)驗(yàn)組(TNF-α 10 ng/mL)；D：實(shí)驗(yàn)組(TNF-α 20 ng/mL)；E：實(shí)驗(yàn)組(TNF-α 50 ng/mL)。

圖4 SCAP經(jīng)含不同濃度TNF-α的成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后的油紅O染色結(jié)果(×100)

2.6 SCAP成血管相關(guān)基因的表達(dá)情況 3、7 d時(shí)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組ANGPT1、VEGFA、PECAM-1表達(dá)量明顯降低，且比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2 TNF-α刺激下SCAP成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)

表3 TNF-α刺激下SCAP血管相關(guān)基因表達(dá)

3 討 論

臨床研究表明，發(fā)生牙髓炎及根尖周炎的年輕恒牙經(jīng)過徹底地清理和消毒后根尖仍能繼續(xù)發(fā)育成形[5]，并認(rèn)為在此過程中SCAP可能發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)SCAP在介導(dǎo)牙本質(zhì)再生及牙根發(fā)育過程中均發(fā)揮著極其重要的作用[6-7]。但牙髓炎及根尖周炎是一種復(fù)雜的炎癥反應(yīng)，當(dāng)年輕恒牙發(fā)生牙髓炎及根尖周炎時(shí)，SCAP會(huì)暴露于炎性環(huán)境中，其中包含以TNF-α 為主的多種炎性因子，且研究表明炎性因子的刺激會(huì)改變干細(xì)胞的生物學(xué)特性，影響其增殖及分化能力[8-9]，故明確炎性因子對SCAP增殖及多向分化能力的影響對牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生及根尖的持續(xù)發(fā)育成形有著不可忽視的作用。

Yang等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)TNF-α可促進(jìn)根尖乳頭細(xì)胞增殖能力。劉彩奇等[11]研究發(fā)現(xiàn)10 ng/mL TNF-α可促進(jìn)SCAP的增殖，提高克隆形成率。于莉等[12]研究也表明10 ng/mL TNF-α促進(jìn)SCAP增殖作用最明顯。本研究結(jié)果與以上研究基本一致,但同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著TNF-α濃度的增加，促進(jìn)SCAP增殖的作用并不會(huì)加強(qiáng)。這可能表明炎性因子TNF-α對SCAP的增殖作用具有濃度的依賴性，高濃度并不能增加促進(jìn)增殖的作用。

TNF-α是1975年由Cors Wells發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)毒素誘導(dǎo)的糖蛋白，到目前為止，研究者們發(fā)現(xiàn)TNF-α通常在健康的牙髓和根尖周組織中檢測不到，而發(fā)生齲病、牙髓炎及根尖周炎時(shí)，牙髓組織和根尖周組織中炎性因子表達(dá)增加，其中TNF-α水平最高[13-15]，這表明TNF-α在牙髓炎癥及根尖周炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。也有學(xué)者研究表明TNF-α?xí)种芐CAP的成骨/成牙本質(zhì)的能力[7-8]。本研究結(jié)果也顯示TNF-α可抑制SCAP礦化結(jié)節(jié)的形成；抑制成骨、血管相關(guān)基因的表達(dá)；同時(shí)抑制SCAP成脂能力。本研究為牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的再生及牙根繼續(xù)發(fā)育提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究采用酶消化法分離培養(yǎng)鼠SCAP，通過不同濃度的TNF-α對SCAP進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明TNF-α可促進(jìn)SCAP的增殖能力，但同時(shí)會(huì)抑制其多向分化能力，為進(jìn)一步研究在炎癥微環(huán)境中SCAP生物學(xué)特性的改變及牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為臨床治療根尖周組織病變的提供了一定的理論依據(jù)。

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Effect of tumor necrosis factor-α on the proliferation and multi-directional differentiation of stem cells from rat apical papilla*

CaoRongrong，MaJunyue，LiShuhui，MaYu，WuPeiling△

(DepartmentofStomatology,theSecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi，theXinjiangUygurAutonomousRegion830063,China)

Objective To evaluate the biological effect of tumor necrosis factor-α(TNF-α) on the proliferation and multi-directional differentiation of stem cells from rat apical papilla(SCAP).Methods SCAP was extracted by combining enzyme digestion method with tissue block method.The cells were divided into control group(TNF-α 0 ng/mL) and experimental group(TNF-α 5,10,20,50 ng/mL).The ability of proliferation of SCAP was measured by MTT method.The ability of osteogenic/dentinogenic differentiation of SCAP was measured by alizarin red staining and quantitative real-time PCR.The ability of adipogenic of SCAP was measured by oil red O staining.The expression of vascular related genes of SCAP was measured by quantitative real-time PCR.Results SCAP was consistent with the characteristics of mesenchymal stem cells and possessed the ability of multi-directional differentiation.The MTT results showed that experimental group promoted the proliferation of SCAP in comparison with the control group.The difference was statistically significant(P<0.05),and 10 ng/mL was the optimum concentration.The results of alizarin red staining showed that with the increase of the concentration of TNF-α,the mineralized nodules in the experimental group gradually became smaller,and the number of the formation decreased gradually.The results of quantitative real-time PCR showed that the expression of OC,DMP-1 and DSPP in the experimental group was significantly lower than that of the control group at 3 and 7 days,in which the expression of OC was statistically significant different(P<0.05);at 14 days,the expression of OC,DMP-1 in the experimental group was significantly lower than that of the control group(P<0.05).The result of Oil red O staining showed that with the increase of the concentration of TNF-α,the lipid droplets formation in the experimental group gradually decreased.The result of quantitative real-time PCR showed that the expression of ANGPT1,VEGFA,PECAM-1 in the experimental group was significantly lower than that of the control group(P<0.05).Conclusion TNF-α might promote the proliferation and inhibit the multi-directional differentiation of SCAP.

stem cells;meristem;tumor necrosis factor-α;stem cells from rat apical papilla;multi-directional differentiation;rats,Wistar

著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.002

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460103)。 作者簡介：曹蓉蓉(1992-)，在讀碩士，主要從事牙體牙髓學(xué)方面研究。△

，E-mail:wplkq@sina.com。

R781.3

A

1671-8348(2017)14-1874-04

2016-11-20

2017-01-08)