人TRB3過表達載體的構(gòu)建及檢測

李楊，胡斌，關(guān)亞萍，徐敏，孟祥軍，3

(1.南京醫(yī)科大學(xué)上海一院臨床醫(yī)學(xué)院 消化科，上海 200080；2.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院 消化科，上海 200080；3.上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院 消化科，上海 200030)

·論 著·

人TRB3過表達載體的構(gòu)建及檢測

李楊1，2，胡斌2，關(guān)亞萍2，徐敏1，2，孟祥軍2，3

(1.南京醫(yī)科大學(xué)上海一院臨床醫(yī)學(xué)院 消化科，上海 200080；2.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院 消化科，上海 200080；3.上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院 消化科，上海 200030)

目的：構(gòu)建TRB3真核表達重組質(zhì)粒，并用肝癌細胞MHCC-97H檢測其表達。方法：從肝癌組織中提取并擴增TRB3基因的編碼區(qū)，將其克隆到真核表達載體pcdh-CMV-MCS-GFP中，酶切并檢定，將克隆成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MHCC-97H細胞中，用qPCR和Western Blot檢測TRB3的表達水平。結(jié)果與結(jié)論：成功擴增了TRB3的編碼區(qū)，并克隆至真核表達載體中；轉(zhuǎn)染后72、96h，MHCC-97H細胞的TRB3 mRNA和蛋白表達顯著增高；成功構(gòu)建的TRB3過表達載體可用于后續(xù)實驗。

TRB3；過表達；肝細胞癌

肝癌是導(dǎo)致人類死亡的第6大惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，2012年全球有745500人死于肝癌，其中大約半數(shù)的病例來自于中國[1]。由于肝癌早期臨床癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時常常處于終末期，手術(shù)切除難度大，藥物化療往往成為終末期肝癌患者的最佳選擇[2]。隨著肝癌分子生物學(xué)研究的不斷深入以及精準(zhǔn)醫(yī)療的提出，人們發(fā)現(xiàn)了許多與肝癌診療相關(guān)的靶基因，TRB3(Tribbles pseudokinase 3)就是其中之一。TRB3最初發(fā)現(xiàn)于果蠅，其含有絲/蘇氨酸蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)，但缺乏ATP的結(jié)合位點，故沒有激酶活性，也被稱為假激酶[3]，其生理功能包括調(diào)節(jié)葡萄糖和脂類代謝、調(diào)節(jié)脂肪細胞分化、調(diào)控膠原表達、參與細胞應(yīng)激和凋亡等[4-5]。近期研究發(fā)現(xiàn)，TRB3與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[6]，但其具體機制仍未被完全闡明。本實驗擬通過構(gòu)建真核TRB3表達載體并使其在肝癌細胞MHCC-97H中穩(wěn)定表達，為進一步研究TRB3對肝癌發(fā)生、發(fā)展的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌組織和細胞系MHCC-97H為上海交通大學(xué)胰腺病重點實驗室保存，載體pcdh-CMV-MCS-GFP、大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α購自上海吉瑪基因公司。DEME培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Sigma公司。DNA限制性內(nèi)切酶(NotI、NsiI、XhoI和NotI)、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶、dNTP、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Fermentas公司?；驕y序由上海吉瑪基因公司完成。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購于Invitrogen 公司；SYBR qPCR 試劑盒購于TaKaRa 公司。人TRB3引物F:GCTGCCAACAGTGGATTGA，R:GCTTCTGCCTTTCTCCCTTCT和HGAPDH引物F：ATGAGAAGTATGACAACAGCCT，R：AGTCCTTCCACGATACCAAAGT均由上海生工生物工程有限公司合成。TRB3多克隆鼠抗購于ABCLONAL公司，GAPDH多克隆鼠抗購于SIGMA公司，山羊抗小鼠HRP標(biāo)記購于JIR公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因獲取和擴增 從人肝癌組織中提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以此為模板通過PCR方法擴增目的基因TRB3。PCR反應(yīng)完成后利用瓊脂糖電泳并切膠回收TRB3基因片段[7]。

1.2.2 真核表達載體的構(gòu)建 用NotI和NsiI對TRB3基因片段進行酶切，用XhoI和NotI對載體pcdh-CMV-MCS-GFP進行酶切。然后用DNA 凝膠回收試劑盒回收TRB3基因片段和載體pcdh-CMV-MCS-GFP，用T4 DNA 連接雙酶切得到TRB3基因片段和線性化的載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，培養(yǎng)16h后選取1孔抽提質(zhì)粒，將抽提好的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定并送測序。將測序結(jié)果與目的基因序列進行比對，正確無誤后，進行大量質(zhì)粒抽提，得到足夠量的重組質(zhì)粒[7]。

1.2.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 肝癌細胞MHCC-97H用含有10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。收集處于對數(shù)生長期的細胞，鋪于6 孔板中，待細胞密度達到80%～90%時進行轉(zhuǎn)染。細胞分為3組：未處理組(B組，未進行轉(zhuǎn)染)、對照組(NC組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)和實驗組(TRB3組，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒)，每組2孔。最后，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書的操作步驟進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72、96h后進行qPCR或Western Blot檢測[8]。

1.2.4 轉(zhuǎn)染后TRB3表達的檢測 分別使用qPCR和Western Blot檢測轉(zhuǎn)錄72、96h后肝癌細胞MHCC-97H的TRB3 mRNA和蛋白表達量[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TRB3基因擴增

用cDNA作為模板進行PCR擴增，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)單一條帶，大小與TRB3實際擴增的大小相符(圖1A)。將雙酶切得到的TRB3片段與線性化的載體用DNA連接酶連接，將載體接入感受態(tài)細胞培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒并進行雙酶切電泳，可見目的基因片段(圖1B)；而后將抽提的質(zhì)粒送公司測序，測序結(jié)果與GenBank中的序列一致，證實TRB3過表達載體構(gòu)建成功。

A.泳道1、2、3、4為人TRB3 PCR擴增產(chǎn)物(如箭頭所示)；B.泳道1為質(zhì)粒酶切后產(chǎn)物，如箭頭所示。M為Fermeatas SM0331標(biāo)記物

A.Lane 1，2，3 and 4 are PCR amplified products of human TRB3(as the arrow showed)；B.Lane 1 is PCR amplified product after double enzymatic digestion(as the arrow showed).M is Fermeatas SM0331 marker

圖1 TRB3目的片段PCR電泳圖

Fig 1 Telectrophresis of TRB3 target fragment

2.2 轉(zhuǎn)染細胞株TRB3基因mRNA的相對表達量

TRB3過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細胞MHCC-97H，4h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72、96h后對細胞進行qPCR檢測。培養(yǎng)72h后，TRB3組的TRB3 mRNA相對表達量高于NC組 (圖2A)；培養(yǎng)96h后，TRB3組的TRB3 mRNA相對表達量同樣高于NC組(圖2B)。

圖2 轉(zhuǎn)染后qPCR檢測TRB3 mRNA的表達

Fig 2 Expression of TRB3 mRNA by qPCR after transfected

2.3 轉(zhuǎn)染細胞株TRB3蛋白的相對表達量

對轉(zhuǎn)染后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)72、96h，進行Western Blot檢測，可見過表達轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)的TRB3蛋白表達水平均顯著增高，說明篩選得到的細胞株為成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒并穩(wěn)定表達TRB3的肝癌細胞MHCC-97H(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染后TRB3蛋白的表達Fig 3 Expression of TRB3 protein by Western Blot after transfect

3 討 論

多項研究結(jié)果已證實，TRB3在包括肝癌、結(jié)直腸癌、舌鱗癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞和人類腫瘤組織中高表達[9]。對TRB3調(diào)控腫瘤的機制研究主要集中在3條信號通路：第一，TRB3可抑制MAPK的激活，從而抑制Ras/Raf以及下游的ERK(extracellular regulated kinase)，改變細胞內(nèi)基因表達狀態(tài)，參與調(diào)控細胞代謝[10]；第二，TRB3可抑制AKT磷酸化，通過調(diào)節(jié)AKT-mTOR通路進而調(diào)控腫瘤細胞的凋亡和自噬[11]；第三，TRB3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)信號途徑相關(guān)，在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡過程中起著重要作用。其中TRB3與ERS是近年的研究熱點。當(dāng)腫瘤細胞不斷生長時，腫瘤周圍代謝產(chǎn)物蓄積，誘導(dǎo)ERS產(chǎn)生，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊和轉(zhuǎn)運蛋白功能下降甚至消失[12]。TRB3作為ERS通路中ATF4-CHOP下游的信號分子，最終介導(dǎo)了細胞的死亡[13]。許多抗腫瘤代謝藥物，例如鹽霉素即可通過調(diào)節(jié)TRB3引起細胞凋亡，說明TRB3可作為某些化療藥物的靶點[14]。

為了進一步探討TRB3在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，深入研究TRB3介導(dǎo)肝癌細胞凋亡的作用機制以及TRB3對肝癌治療的意義，我們成功地構(gòu)建了TRB3過表達真核載體，并檢測轉(zhuǎn)染細胞后其蛋白和mRNA表達情況，為后續(xù)的研究提供了有利工具。

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Construction and identification of human TRB3 gene overexpression vector

LI Yang1，2，HU Bin2，GUAN Ya-ping2，XU min2，MENG Xiang-jun2，3

(1.DepartmentofGastroenterology，ShanghaiFirstPeople′sHospitalofNanjingMedicalUniversity，Shanghai200080，China；2.DepartmentofGastroenterology，ShanghaiFirstPeople′sHospitalofShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200080，China；3.DepartmentofGastroenterology，ShanghaiNinthPeople′sHospitalofShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200080，China)

Objective: To construct human TRB3 gene overexpression vector and identify its expression in hepatocellular carcinoma cells MHCC-97H.Methods: TRB3 gene was extracted from liver cancer tissue of human and amplified it by reverse transcription.Then it was cloned into pcdh-CMV-MCS-GFP vector for constructing eukaryotic expression vector.The successful cloned vector was transfected into hepatocellular carcinoma cells MHCC-97H，and TRB3 expression was determined by qPCR and Western blot.Results and Conclusion：The coding region of human TRB3 gene is successfully amplified，and cloned into the vector；the expression of TRB3 mRNA and protein are upregulated in MHCC-97H cells after transfected；TRB3 overexpression vector is successfully constructed，which could be used into the post-study.

TRB3；overexpression；hepatocellular carcinoma

2016-06-18

2016-08-30

國家自然科學(xué)基金面上項目(81072007)；江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程項目(SJLX15_0433)

李楊(1990-)，男，安徽滁州人，在讀碩士研究生。 E-mail：ayly0550@163.com

孟祥軍 E-mail：xiangjunmeng@aliyun.com

李楊，胡斌，關(guān)亞萍，等.人TRB3過表達載體的構(gòu)建及檢測[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2017，36(1)：17-20.

R734.7

A

1671-6264(2017)01-0017-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.005