塞來昔布對脂多糖誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型炎癥因子的影響

龐逸敏+++甘露+++王獻哲++蘇棋+++郭哲+++何萍

[摘要]目的 建立脂多糖（LPS）誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型，探討塞來昔布對其分泌炎癥因子的影響。方法 培養小鼠RAW 264.7巨噬細胞，采用1 μg/ml的LPS刺激小鼠RAW 264.7巨噬細胞24 h后，收集細胞培養基，采用Griess法測定一氧化氮（NO）及ELISA法測定腫瘤壞死因子α（TNF-α）、前列腺素E2（PGE2）的含量，從而建立LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型。采用MTT法檢測塞來昔布對LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞的毒性作用后，選用8.00 μmol/L塞來昔布預處理細胞1 h，再加入1 μg/ml LPS刺激細胞24 h，收集細胞培養基，測定培養基中炎癥因子NO、TNF-α及PGE2的含量。結果 1 μg/ml的LPS刺激RAW 264.7巨噬細胞24 h后，細胞形態出現明顯變形，細胞培養基中炎癥因子NO及TNF-α、PGE2含量均較正常對照組明顯增高（P<0.01）。與DMSO溶劑對照組相比，8.00 μmol/L塞來昔布組能明顯抑制LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎性因子NO、TNF-α及PGE2的釋放（均P<0.01）。結論 成功建立LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型，塞來昔布可明顯抑制其炎癥因子NO、TNF-α及PGE2的分泌。

[關鍵詞]塞來昔布；RAW 264.7巨噬細胞；脂多糖；一氧化氮；腫瘤壞死因子α；前列腺素E2

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（a）-0004-04

Influence of Celecoxib on inflammatory cytokines of inflammation model in RAW 264.7 macrophages induced by lipopolysaccharide

PANG Yi-min1 GAN Lu1 WANG Xian-zhe1 SU Qi1

1.Department of Pharmacology，School of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2.Department of Emergency，the Third Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；3.Laboratory Animal Center，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

[Abstract]Objective To investigate the influence of Celecoxib on the secretion of inflammatory cytokines in RAW 264.7 macrophages model induced by lipopolysaccharide （LPS）.Methods Mouse RAW 264.7 macrophage was cultured.24 h after mouse RAW 264.7 macrophage was stimulated by LPS 1 μg/ml，then cell culture medium was collected.NO was tested by using Griess and the content of TNF-α and PGE2 was tested by ELISA.Then the RAW 264.7 macrophage inflammation model was established.The toxic effect of celecoxib on LPS stimulated RAW 264.7 macrophages assayed by MTT.8.00 μmol/L Celecoxib was used to pretreat cell for 1 h，following of 1 μg/ml LPS added to stimulate cell for 24 h.Cell culture medium was collected to test the content of inflammatory factors NO，TNF-α and PGE2 in culture medium.Results After 1 μg/ml of LPS stimulated RAW macrophages for 24 h，cell morphology changed obviously，the content of inflammatory factors NO，TNF-α and PGE2 in culture medium were obvious higher than those of the control group （P<0.01）.Compared with DMSO control group，8.00 μmol/L Celecoxib group could significantly inhibit the release of inflammatory cytokines NO，TNF-α and PGE2 induced by LPS in RAW 264.7 cells （P<0.01）.Conclusion Establishment of LPS induced macrophage model of RAW 264.7 and celecoxib can obvious inhibit the release of inflammatory cytokines NO，TNF-α and PGE2.

[Key words]Celecoxib；RAW 264.7 macrophage；Lipopoly-saccharide；NO；TNF-α；PGE2

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是嚴重危害人類健康的常見病與多發病，也是冠心病、腦梗死、外周血管病的主要原因。近年來，AS被普遍理解為一種發生在血管壁的慢性炎癥[1]。巨噬細胞是AS炎癥病理過程中的代表性細胞，巨噬細胞及巨噬細胞相關的主要生物大分子在AS的發生、發展全過程中起重要作用[2]。RAW 264.7細胞是小鼠腫瘤來源的單核/巨噬細胞系株，被細菌內毒素的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后會釋放多種過量的炎癥因子，是AS研究中常用的炎癥細胞模型。

環氧合酶-2（COX-2）選擇性抑制劑是目前廣泛使用的非甾體類抗炎藥（NSAIDs）。與傳統的NSAIDs相比，COX-2選擇性抑制劑在具有鎮痛、抗炎作用的同時，也具有良好的胃腸道安全性[3]。但自21世紀初以來，默克公司宣布全球主動撤回高選擇性COX-2抑制劑羅非昔布的舉動，引起了全球對于COX-2選擇性抑制劑心血管危險的關注。大量研究顯示，對于原有心血管病疾病的患者，COX-2選擇性抑制劑可能增加心肌梗死、腦卒中等嚴重心腦血管方面的危險[4-6]，而COX-2選擇性抑制劑對AS的作用也始終存在爭議[7]。

本研究以小鼠RAW 264.7巨噬細胞為研究對象，采用LPS誘導其活化建立巨噬細胞炎癥模型，同時觀察COX-2選擇性抑制劑塞來昔布（Celecoxib）對LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子分泌的影響，以初步探討COX-2選擇性抑制劑對AS及相關心腦血管疾病的影響及其可能機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株與試劑 塞來昔布（純度≥98%，Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司）；小鼠RAW264.7巨噬細胞（中國科學院上海細胞庫）；DMEM高糖培養基（Hyclone公司）；胎牛血清（GemCell公司）；青鏈霉素混合液（100×）（北京索萊寶科技有限公司）；脂多糖（LPS L2880，Sigma公司）；MTT（Biosharp生物科技）；一氧化氮（NO）試劑盒（碧云天生物公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（武漢博士德公司）；前列腺素E2（PGE2）ELISA試劑盒（美國Cayman公司）。

1.1.2儀器 酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

1.2方法

1.2.1小鼠RAW 264.7巨噬細胞的培養 將RAW 264.7巨噬細胞接種在含10%胎牛血清（<0.5 EU/ml）、1%青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱內培養。當細胞覆蓋率達到約90%時，棄掉上清，直接加入37℃培養基吹打傳代。取對數期細胞用于后續實驗。

1.2.2 LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型的建立 取對數期生長的RAW 264.7細胞以每孔20×103個細胞接種于96孔細胞培養板中，待24 h細胞貼壁后，設置正常對照組和LPS模型組，每組6個復孔。正常對照組以無血清DMEM培養基孵育細胞，LPS模型組則以含1 μg/ml LPS的無血清DMEM培養基孵育細胞，孵育24 h后，觀察細胞形態變化，并收集細胞培養基測定炎癥因子NO及TNF-α、PGE2含量[8]。

1.2.3 MTT法檢測塞來昔布對LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞的細胞毒性試驗 取對數期生長的RAW 264.7細胞以每孔3×103個細胞接種于96孔細胞培養板中，待24 h細胞貼壁后，設置正常對照組、LPS模型組、塞來昔布組（塞來昔布+LPS）及DMSO溶劑對照組（DMSO+LPS），每組6個復孔。正常對照組和LPS模型組先以無血清DMEM培養基孵育細胞，塞來昔布組分別以含終濃度為40.00、30.00、10.00、8.00、3.00、1.00、0.30、0.10、0.03 μmol/L塞來昔布的無血清DMEM孵育細胞，DMSO溶劑對照組則在無血清DMEM中加入等體積DMSO孵育細胞。按上述處理方式孵育細胞1 h后，除正常對照組采用無血清DMEM繼續孵育外，其余各組再加入終濃度為1 μg/ml LPS刺激細胞，24 h后收集各孔培養基，在每孔中加入5 g/L MTT 10 μl，補足DMEM至100 μl（MTT終濃度為0.5 g/L），繼續培養4 h后棄上清，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min，在570 nm處測量各孔的吸光度。

1.2.4塞來昔布對LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥因子分泌的影響 取對數期生長的細胞以每孔20×103個細胞接種于96孔的細胞培養板中，待24 h細胞貼壁后，設置正常對照組、塞來昔布組（塞來昔布+LPS）及DMSO溶劑對照組（DMSO+LPS），每組6個復孔。各組處理方式同“1.2.3”，塞來昔布組僅采用8 μmol/L塞來昔布孵育細胞。以上三組分別處理完畢后，收集細胞培養基測定炎癥因子NO及TNF-α、PGE2的含量。

1.2.5 NO、TNF-α和PGE2的含量測定 按上述處理方式收集各孔細胞培養基后，分別采用Griess法測定NO及ELISA法測定TNF-α、PGE2含量，操作參照試劑盒說明書進行。

1.3統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行處理，計量資料以x±s表示，兩樣本均數的比較采用Student T-Test檢驗，多樣本組間均數的比較采用One-way ANOVA檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥細胞模型的建立

作用24 h后在顯微鏡下進行形態學觀察，正常對照組RAW 264.7巨噬細胞體積較小，呈邊緣明亮的類圓形，偶有細長觸角，符合巨噬細胞形態；經1 μg/ml LPS刺激24 h后，細胞體積明顯增大并伸出大量偽足，呈菱形、梭形、長條形等不規則形狀，且細胞內有大量空泡。與正常對照組相比，LPS模型組NO及TNF-α、PGE2含量均明顯增高（P<0.01）（圖1、圖2）。

2.2 MTT法測定塞來昔布對LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞的細胞毒性試驗

經MTT法檢測，LPS模型組及DMSO溶劑對照組的細胞存活率與正常對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。40、30 μmol/L塞來昔布組的細胞存活率較正常對照組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）；10.00、8.00、3.00、1.00、0.30、0.10、0.03 μmol/L塞來昔布組的細胞存活率則與正常對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05），且8.00 μmol/L塞來昔布組的細胞存活率接近100%，故選用8 μmol/L塞來昔布進行后續實驗。

2.3塞來昔布對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥因子分泌的影響

與正常對照組相比，DMSO溶劑對照組炎癥因子NO、TNF-α及PGE2的含量均明顯增高（P<0.01）；與DMSO溶劑對照組相比，8 μmol/L塞來昔布組能明顯抑制LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎性因子NO、TNF-α及PGE2的分泌（均P<0.01）。

3討論

炎癥反應是多細胞因子通過調節促炎和抗炎系統之間的平衡而參與炎癥發生、發展的過程。目前，在體外細胞炎癥模型制作中，LPS是最主要、作用最強的促炎手段。LPS是革蘭陰性桿菌細胞壁外膜的主要組分，能誘導活化炎癥細胞引起炎癥反應，從而導致多種促炎性細胞因子的產生，促炎性細胞因子的分泌可誘導炎性細胞的進一步激活，從而導致過度或失控的炎癥反應，最終引起組織器官的炎性病理損傷。

AS具有慢性炎癥反應特征的病理過程，其發展始終伴隨炎癥反應。單核/巨噬細胞是AS炎癥反應的重要效應細胞，一方面，巨噬細胞產生多種炎性細胞因子，促進血栓形成，擴大斑塊面積，增加斑塊的不穩定性，在AS病理過程中發揮關鍵作用；另一方面，巨噬細胞也可產生如白細胞介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β（TGF-β）等抗炎因子，增加AS斑塊的穩定性，進而起保護作用[9]。

炎癥因子TNF-α、NO及PGE2作為經典的急性炎癥早期細胞因子，常用于衡量炎癥模型成功與否的標準[10-11]。其中，TNF-α是巨噬細胞在炎癥反應中產生的主要促炎細胞因子，在機體中可影響包括細胞增殖、分化及凋亡等一系列細胞功能的調節，其表達增加還可促進氧自由基的產生導致內皮功能紊亂，是AS進程中非常重要炎性因子[12]。NO是一種有重要生物學意義的無機小分子，具有殺滅細菌等病原體微生物活化巨噬細胞的作用[13]，能夠介導炎癥反應。NO由一氧化氮合酶（NOS）經一系列氧化還原反應生成，在動脈粥樣硬化浸潤的巨噬細胞中，誘導型一氧化氮合酶（iNOS）表達增高，由iNOS衍生的過量NO誘導的硝化應激會引起過度炎癥反應，加重動脈粥樣硬化[14]。PGE2是COX-2的主要代謝產物，COX是催化花生四烯酸（AA）合成各種內源性前列腺素（PGs）和血栓素（TXs）的限速酶。COX主要分為COX-1和COX-2，其中COX-2酶為誘導型酶。COX-2通常被認為主要與炎癥等過程中PGs的生成相關，與AS的發生發展成正相關。COX-2表達局限在粥樣斑塊的巨噬細胞/泡沫細胞、平滑肌細胞和內皮細胞中，在炎性因素影響下COX-2及其產物PGE2可被迅速誘導表達，促進AS炎癥反應的發生和發展[15]。本實驗結果顯示，1 μg/ml LPS誘導24 h后，RAW 264.7巨噬細胞發生了明顯的活化的形態學改變，炎癥因子NO、TNF-α及PGE2分泌水平亦較正常對照組顯著上升，差異有統計學意義（P<0.01），提示已成功建立LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型。

雖然較多實驗發現COX-2抑制劑能減輕血管炎癥、減少單核細胞浸潤、改善血管壁細胞功能而延緩AS進程、增加斑塊穩定性，從而減少AS血栓事件[16]，但也有COX-2抑制劑加重AS[17]或對AS無影響[18]的報道。為探討COX-2選擇性抑制劑對AS及相關心腦血管疾病的影響及可能機制，在成功建立LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型基礎上，本實驗初步觀察了COX-2選擇性抑制劑塞來昔布對LPS誘導的巨噬細胞部分炎癥因子分泌的影響。MTT結果顯示，0.03～10.00 μmol/L的塞來昔布對LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞無明顯細胞毒性（與正常對照組比較，P<0.05）。以細胞存活率接近100%的8.00 μmol/L塞來昔布作用于LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞后，可明顯抑制LPS誘導的RAW 246.7巨噬細胞炎癥因子NO、TNF-α及PGE2的分泌。塞來昔布通過選擇性抑制COX-2酶可抑制炎癥因子PGE2的生成，但塞來昔布通過何種機制抑制炎癥因子NO及TNF-α的生成？此外，塞來昔布在抑制NO、TNF-α及PGE2等炎癥因子分泌的同時，為何卻可增加AS及相關心血管事件的發生？因此，有必要在此炎癥細胞模型基礎上展開進一步研究。

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（收稿日期：2017-02-24 本文編輯：祁海文）