食管胃結合部腺癌中RAD51蛋白的表達及臨床意義

閆靜波，衛 茹，李永才，李 輝，竇 艷，劉鐘歆，陳江偉

食管胃結合部腺癌中RAD51蛋白的表達及臨床意義

閆靜波1，衛 茹2，李永才3，李 輝4，竇 艷1，劉鐘歆1，陳江偉1

目的 探討RAD51蛋白在食管胃結合部腺癌中的表達及臨床意義。方法 采用免疫組化和Western blot法檢測141例正常胃黏膜、112例胃黏膜上皮內瘤變及141例食管胃結合部腺癌中RAD51蛋白的表達，并分析其表達與食管胃結合部腺癌的臨床病理學征特的關系。結果 免疫組化檢測RAD51蛋白在正常胃黏膜組、低級別瘤變組、高級別瘤變組、食管胃結合部癌組織中的陽性率分別為8.51%、20.45%、44.12%和72.34%(P<0.05)；Western blot檢測結果分別為1、2.29±0.08、4.97±0.24、8.13±1.03(P<0.05)，提示RAD51蛋白表達為逐漸升高的趨勢。RAD51蛋白表達與食管胃結合部腺癌的病理分化程度、Lauren分型及有無淋巴結轉移相關(P<0.05)。結論 RAD51在食管胃結合部腺癌的發生、發展過程中起重要作用。

食管胃結合部腫瘤；腺癌；上皮內瘤變；RAD51；Western blot

食管胃結合部腺癌(adenocarcinoma of esophagogastric junction, AEGJ)在河北省南部發病率較高。AEGJ最常用的分型是Siewert分型[1]：腫瘤中心位于胃食管交界(esophagogastric junction, EGJ)及上下各5 cm范圍內的腺癌為AEGJ，AEGJ分為三種類型：SiewertⅠ～Ⅲ型，Ⅱ、Ⅲ型相對多見，Ⅰ型相對少見[2]。RAD51是一種DNA雙鏈斷裂修復蛋白，在同源重組修復中起重要作用。RAD51蛋白及其DNA和mRNA水平的改變，能夠影響腫瘤發生、發展及其生物學行為。RAD51蛋白低表達，會造成胚胎死亡；RAD51蛋白適量表達，能修復自發性的DNA損傷；然而，RAD51蛋白過表達，能促進腫瘤的發生、發展，增強腫瘤對放、化療的耐受性[3]。本實驗采用免疫組化和Western blot法檢測RAD51蛋白在AEGJ組織中的表達，探討RAD51蛋白在AEGJ中表達的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2005～2015年河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院病理科存檔的141例AEGJ標本，并且均經一位病理副主任醫師初診和一位病理主任醫師復診。另選取141例正常胃黏膜和112例胃黏膜上皮內瘤變作為對照。141例AEGJ患者術前未行放、化療，男性93例，女性48例；年齡<50歲者56例，≥50歲者85例；腫瘤最大直徑<4 cm者78例，≥4 cm者63例；組織學分化：高分化50例，中+低分化91例；Lauren分型：腸型85例，彌漫型56例；癌組織侵犯：黏膜層或黏膜下層(早期胃癌)32例，侵及肌層或漿膜層(中晚期胃癌)109例；無淋巴結轉移者81例，淋巴結轉移者60例；SiewertⅠ型6例，SiewertⅡ型71例，SiewertⅢ型64例。112例胃黏膜上皮內瘤變中低級別上皮內瘤變44例，高級別上皮內瘤變68例。141例胃黏膜均取自胃癌標本距腫物5 cm遠的正常黏膜。以上3組標本，分為兩份：一份經10%中性福爾馬林固定，行HE和免疫組化染色；另一份放入液氮凍存，行Western blot檢測。

1.2 免疫組化 RAD51單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，濃度為1 mg/mL，按照1 ∶300進行稀釋。免疫組化染色采用EnVision兩步法。RAD51蛋白表達定位于胞質和胞核。(1)根據著色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據陽性細胞占總細胞數百分比計分：陽性細胞數﹤10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。將兩項得分結果相乘：0～1分為(-)，≥2分為(+)。

1.3 Western blot法 提取AEGJ組的蛋白，參照蛋白標準曲線測定蛋白含量，做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠內的樣品蛋白轉移至硝酸纖維膜上，5%BSA常溫振蕩封閉1 h。一抗(RAD51抗體)4 ℃過夜，二抗室溫1 h。然后加入堿性磷酸酶顯色劑顯色20 min。用掃描儀掃描硝酸纖維素膜上蛋白表達條帶的灰度，用自動圖像分析系統進行定量分析，正常胃黏膜組的平均光密度值(OD值)取值為1，其它各組與正常胃黏膜組相比取值。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學處理，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化法檢測RAD51的表達 RAD51蛋白在正常胃黏膜組、低級別上皮內瘤變組、高級別上皮內瘤變組和AEGJ組的陽性率逐漸增高(P<0.05，表1，圖1)。

表1 黏膜組、瘤變組、腺癌組中RAD51的表達

ABCD

圖1 RAD51在正常胃黏膜組(A)、上皮內瘤變組(B)、高分化腺癌(C)和低分化腺癌(D)中的表達，EnVision兩步法

2.2 Western blot法檢測RAD51的表達 Western blot結果顯示：RAD51蛋白表達在正常胃黏膜組、低級別瘤變組、高級別瘤變組、食管胃結合部癌分別為1、2.29±0.08、4.97±0.24、8.13±1.03，RAD51蛋白的表達逐漸升高(P<0.05，圖2)。

圖2 Western blot法檢測RAD51的表達

1.正常胃黏膜組；2.低級別上皮內瘤變組；3.高級別上皮內瘤變組；4.食管胃結合部腺癌組

2.3 RAD51表達與AEGJ臨床病理特征的關系 實驗結果顯示，RAD51表達與患者年齡、性別、侵犯深度、腫瘤大小及Siewert分型無關(P>0.05)。RAD51表達與AEGJ病理分化程度、Lauren分型及有無淋巴結轉移相關(P<0.05)。RAD51蛋白在中+低分化胃腺癌中的表達高于高分化胃腺癌(圖1)；Lauren分型中，RAD51蛋白在彌漫型胃腺癌的表達高于腸型胃腺癌；RAD51蛋白在有淋巴結轉移胃腺癌中的表達高于無淋巴結轉移胃腺癌(表2)。

表2 RAD51表達與食管胃結合部腺癌臨床病理特征的關系

3 討論

AEGJ即腫瘤位于EGJ上下5 cm范圍內的腺癌，過去被稱為胃上部癌。近年來，胃竇癌發病率呈下降趨勢；然而，AEGJ的發病率卻持續升高。AEGJ進展快，預后較差，約80%的AEGJ發現時已為晚期，AEGJ的5年生存率﹤30%[4]，與胃竇癌相比，AEGJ較早深層胃壁浸潤、轉移及復發[5-6]。AEGJ最常用的分型為Siewer分型，可分為三種類型：SiewertⅠ型：即EGJ，腫瘤的中心位于EGJ以上1～5 cm距離，以往稱為食管下段腺癌；SiewertⅡ型，即腫瘤的中心位于EGJ上1 cm到下2 cm的距離，以往稱為賁門癌；Siewert Ⅲ型，即腫瘤中心位于EGJ下2～5 cm的距離，過去稱為賁門下癌或胃底癌。SiewertⅠ型預后最好，SiewertⅡ型次之，SiewertⅢ型最差。在西方國家，這三種類型的發病率基本相同；在我國SiewertⅠ少見，而SiewertⅡ和Ⅲ多見。肖文光等[7]的研究結果顯示，我國SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型所占比例分別為3.9%、53.1%和43.0%；楊宏等[8]的研究結果顯示，我國SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型所占比例分別為4.7%、50.3%和45.0%。本組141例AEGJ中，SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分別為6、71、64例，所占比例分別為4.3%、50.3%、45.4%，結果與文獻[7-8]報道基本一致。

RAD51蛋白是一種DNA雙鏈斷裂修復蛋白，在同源重組修復中起重要作用，參與DNA損傷感應和細胞周期關卡的復雜信號通路，通過同源重組修復，RAD51蛋白可以保護細胞免受DNA損傷[9]。然而，過多的RAD51蛋白又會過量的刺激同源重組以及姐妹染色體的交換，結果會引起基因的不穩定性以及遺傳的差異，調節腫瘤細胞增殖以及信息傳遞，結果引起瘤細胞明顯的增生失控以及分化成熟障礙，從而導致腫瘤的發生，并造成腫瘤細胞對放、化療耐藥和預后不良[10]。RAD51蛋白有兩個關鍵肽段，也是目前研究較多的抑癌基因產物，即191-220以及231-260，與其對應的序列分別為YARAFNTDHQTQLLYQASAM-MVESRYALLI以及DYSGRGELSARQMHLARFLRMLLRLADEFG[11]。RAD51蛋白的一些關鍵氨基酸如果發生突變，就會引起該基因的失活，結果引起腫瘤形成。RAD51蛋白在多種腫瘤中高表達，如乳腺腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、胰腺腫瘤以及膀胱腫瘤等[12]。

本組免疫組化和Western blot檢測結果顯示，RAD51蛋白在正常胃黏膜組、低級別上皮內瘤變組、高級別上皮內瘤變組和AEGJ組中的表達逐漸升高(P<0.05)；RAD51蛋白在中+低分化胃腺癌中的表達強于高分化胃腺癌。結果顯示，RAD51蛋白在正常胃黏膜、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變、高分化腺癌、低分化腺癌中的表達逐漸升高，說明RAD51蛋白可能促進食管胃結合部黏膜的癌變以及腫瘤的發生、發展。

本組實驗顯示，RAD51蛋白表達與患者年齡、性別、侵犯深度、腫瘤大小及Siewert分型無關(P>0.05)；RAD51蛋白表達與AEGJ病理分化程度、Lauren分型以及有無淋巴結轉移相關(P<0.05)，RAD51蛋白在中+低分化胃腺癌的表達高于高分化胃腺癌；Lauren分型中，RAD51蛋白在彌漫型胃腺癌的表達高于腸型胃腺癌；RAD51蛋白在有淋巴結轉移胃腺癌中的表達高于無淋巴結轉移的胃腺癌，這說明RAD51可能與AEGJ分化程度、發生發展、預后有一定的關系，其可能是判斷腫瘤惡性程度高低及分級、分期的重要標志。隨著腫瘤的進展，惡性程度的增高，RAD51蛋白表達升高，提示RAD51蛋白可能促進AEGJ的發生、發展。RAD51蛋白在有淋巴結轉移組中的表達升高，提示RAD51蛋白可能促進了AEGJ的淋巴結轉移，有淋巴結轉移的患者預后則差，因此，RAD51蛋白的表達水平能夠作為判斷AEGJ患者預后的參考指標。彌漫型胃腺癌RAD51蛋白表達高于腸型胃腺癌，彌漫型胃腺癌主要包括低分化腺癌及印戒細胞癌，惡性程度相對較高，預后較差，而腸型胃腺癌主要指高分化腺癌，惡性程度相對較低，預后較好，仍然提示RAD51蛋白在低分化胃腺癌中表達高，RAD51蛋白可能促進了腫瘤的發生、發展，RAD51蛋白升高，患者預后較差。Raderschall等[13]的研究結果顯示，如果腫瘤細胞內RAD51蛋白升高，腫瘤細胞對化療藥物和電離輻射敏感性降低；如果腫瘤細胞RAD51蛋白降低，癌細胞對放、化療敏感性升高[14]。RAD51蛋白在腫瘤細胞內表達升高可造成腫瘤細胞基因組不穩定及腫瘤細胞對放、化療不敏感。以RAD51為治療靶點，蛋白質組學與基因治療技術相結合的技術，能夠提高腫瘤細胞對放、化療的敏感性，有可能成為腫瘤治療的新方法。

綜上所述，RAD51蛋白在正常胃黏膜、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變、高分化腺癌、低分化腺癌中表達逐漸升高，說明RAD51蛋白可能與胃黏膜的癌變、AEGJ的發生、發展有一定關系。RAD51蛋白表達與AEGJ病理分化程度、Lauren分型及有無淋巴結轉移有關，實驗推測RAD51與AEGJ的生物學行為及患者預后密切相關。深入探討RAD51蛋白在AEGJ中的表達，為臨床治療尋找新的有效途徑。

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1河北省邢臺市人民醫院病理科、3影像科、4外科，邢臺 0540012河北省邢臺市醫學高等專科學校，邢臺 054000

閆靜波，男，碩士研究生，副主任醫師。E-mail: yanjingbo2012@163.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.020.html

R 735.2

A

1001-7399(2017)04-0439-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.020

接受日期：2016-12-15