膀胱尿路上皮癌中DAB2IP和β-catenin的表達及臨床意義

鄭林峰，倪型灝，程國平，楊世峰

膀胱尿路上皮癌中DAB2IP和β-catenin的表達及臨床意義

鄭林峰，倪型灝，程國平，楊世峰

目的 探討DAB2相互作用蛋白(DOC-2/DAB2 interactive protein, DAB2IP)及β-連環蛋白(β-catenin)在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BUC)中的表達及臨床意義。方法 采用免疫組化EnVision兩步法檢測104例BUC組織和40例癌旁正常膀胱黏膜組織中DAB2IP及β-catenin蛋白表達，并分析兩者表達與BUC臨床病理特征及預后的關系。結果 BUC組織中DAB2IP蛋白表達明顯低于癌旁正常膀胱黏膜組織，β-catenin蛋白表達明顯高于癌旁正常膀胱黏膜組織(P<0.05)。DAB2IP蛋白表達與BUC組織學分級、病理分期及5年生存率差異有顯著性(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑以及初發/復發患者無相關性(P>0.05)。β-catenin蛋白表達與BUC患者年齡、組織學分級、病理分期、腫瘤直徑及5年生存率有相關性(P<0.05)，與患者性別以及初發/復發患者無相關性(P>0.05)。BUC組織中DAB2IP及β-catenin蛋白表達呈負相關(P<0.05)。結論 BUC組織中DAB2IP表達下調，β-catenin表達升高，且兩者表達呈負相關，DAB2IP和β-catenin異常表達與BUC組織學分級、病理分期及預后有關。

膀胱腫瘤；尿路上皮癌；DAB2IP；β-catenin；免疫組織化學

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一。2012年美國新診斷的膀胱癌患者男性55 600例，女性17 910例，其中10 510例男性和4 370例女性死于膀胱癌[1]。膀胱癌的發生、發展受多種基因的調控，但至今尚無單一的腫瘤標志物被廣泛認可。DAB2相互作用蛋白(DOC-2/DAB2 interactive protein, DAB2IP)是新近發現的Ras-鳥苷三磷酸酶激活蛋白(Ras GTPase activating protein, Ras-GAP)家族的新成員，具有調控細胞凋亡、抑制血管生成、抑制腫瘤生長、轉移和放療耐受等生物學功能[2]。β-catenin是上皮鈣黏素-連環素復合體的重要組成部分，參與同型細胞間的識別和黏附，同時還作為Wnt信號通路中的轉導分子在細胞轉錄中起重要作用[3]。Xie等[4]發現，DAB2IP能調節GSK-3β-βcatenin信號通路，并且與上皮-間質細胞轉變(epithelial mesenchymal transition, EMT)有關。本文現采用免疫組化EnVision兩步法檢測DAB2IP及β-catenin蛋白在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma, BUC)和正常膀胱黏膜中的表達，初步探討兩者在膀胱癌發生、發展的作用及其相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集浙江省腫瘤醫院2009年1月～2014年12月膀胱癌根治標本104例及其癌旁組織標本(距癌旁>2 cm)40例，所有患者術前均未行基因治療、放化療及免疫治療等。BUC組中男性92例，女性12例；年齡27～84歲，平均(62.66±1.16)歲，中位年齡65歲，其中<63歲者47例，≥63歲者57例；腫瘤直徑<2 cm者16例，≥2 cm者88例；初發膀胱癌76例，復發者28例。根據WHO(2016)泌尿和男性生殖系統腫瘤分類標準，其中非浸潤性尿路上皮癌11例，浸潤性尿路上皮癌93例；低級別40例，高級別64例；臨床分期Tis-T1期52例，T2-T4期52例。正常膀胱黏膜組中男性28例，女性12例；年齡40～84歲，平均(57.53±1.02)歲，中位年齡60歲。所有標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續切片，行HE及免疫組化染色，且由兩名有經驗的病理醫師鏡下觀察切片。

1.2 免疫組化 兔抗人DAB2IP多克隆抗體(美國Abcam公司)及鼠抗人β-catenin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)均按1 ∶200稀釋。所有組織標本4 μm厚連續切片。免疫組化染色采用EnVision兩步法，EDTA(pH 9.0)水浴抗原修復，一抗1 h、二抗20 min室溫孵育，DAB顯色10 min，蘇木精復染、封固。采用已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定 DAB2IP蛋白表達陽性判斷標準：以膀胱癌及正常黏膜上皮細胞質內出現棕色至深棕色顆粒為陽性細胞。由兩位病理專業醫師進行閱片，取平均值為最后結果。(1)按染色比例計分：陽性細胞數1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；(2)按染色強度計分：陰性為0分，弱陽性為1分，中等陽性為2分，強陽性為3分，將兩項得分結果相加：總分<3分為DAB2IP陰性，≥3分為DAB2IP陽性。β-catenin在正常膀胱組織中主要表達于細胞膜，在膀胱癌則主要以胞質或胞核著色為異常表達，陽性細胞數≥10%為陽性，<10%為陰性。

1.4 統計學分析 應用SPSS 21.0軟件進行統計學處理，組間比較及臨床病理指標的相互關系采用χ2檢驗和Fisher確切概率法，采用Spearman等級相關檢驗對DAB2IP和β-catenin在膀胱癌中的相互間關系進行分析，Kaplan-Meier法分析生存情況，生存曲線比較采用Log-rank檢驗，采用Cox比例風險回歸模型分析多因素對預后的影響。

2 結果

2.1 BUC及癌旁正常膀胱組織中DAB2IP和β-catenin蛋白的表達 BUC及癌旁正常膀胱組織中DAB2IP陽性率分別為42.30%(44/104)、90%(36/40)，兩者差異有顯著性(P<0.05)；β-catenin在BUC及癌旁正常膀胱組織的陽性率分別為57.69%(60/104)、7.5%(3/40)，兩者差異有顯著性(P<0.05，圖1～3，表1)。

①A①B①C②A②B②C③A③B③C

圖1 DAB2IP和β-catenin蛋白在正常膀胱黏膜中的表達：A.正常膀胱黏膜HE染色；B.DAB2IP呈強陽性；C.β-catenin胞膜陽性，EnVision兩步法 圖2 DAB2IP和β-catenin蛋白在低級別非浸潤性膀胱尿路上皮癌中的表達：A.低級別非浸潤性尿路上皮癌HE染色；B.DAB2IP呈陽性；C.β-catenin呈胞質及胞核陽性，EnVision兩步法 圖3 DAB2IP和β-catenin蛋白在高級別浸潤性尿路上皮癌中的表達：A.高級別浸潤性尿路上皮癌HE染色；B.DAB2IP呈陰性；C.β-catenin呈胞質及胞核強陽性，EnVision兩步法

表1 膀胱尿路上皮癌及癌旁正常膀胱組織中DAB2IP和β-catenin蛋白的表達[n(%)]

2.2 DAB2IP和β-catenin蛋白表達與BUC臨床病理特征的關系 DAB2IP蛋白表達與BUC病理組織學分級、臨床病理分期間有關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑以及初發/復發情況無關(P>0.05)。β-catenin蛋白表達與BUC年齡、病理組織學分級、臨床病理分期及腫瘤直徑有關(P<0.05)，與患者性別以及初發/復發情況無關(P>0.05，表2)。BUC組織中DAB2IP和β-catenin蛋白表達呈負相關(r=-0.330，P<0.05，表3)。

表2 膀胱尿路上皮癌中DAB2IP和β-catenin蛋白表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

表3 膀胱尿路上皮癌中DAB2IP和β-catenin蛋白表達的相關性

2.3 DAB2IP和β-catenin蛋白表達與BUC預后的關系 本組104例BUC患者最短生存時間為7個月，最長為82個月，平均生存期(36.54±2.00)個月，中位生存時間31.5個月。Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗分析結果顯示，患者5年總體生存率為60.57%(63/104)，DAB2IP蛋白陰性和陽性者的5年生存率分別為43.33%和84.09%，兩者差異有統計學意義(χ2=20.38，P<0.001)。β-catenin蛋白陰性和陽性者的5年生存率分別為72.72%和51.66%，兩者差異有統計學意義(χ2=8.894，P=0.003，圖4、5)。

圖4 膀胱尿路上皮癌中DAB2IP表達與患者生存率的關系

圖5 膀胱尿路上皮癌中β-catenin表達與患者生存率的關系

2.4 Cox比例風險回歸模型分析多因素對預后的影響 單因素Cox模型分析：將DAB2IP蛋白、β-catenin蛋白以及BUC臨床病理特征逐個引入Cox模型，結果顯示與BUC預后相關有顯著意義的因素有5個，分別為保護因素：DAB2IP蛋白(95%CI：0.083～0.428)；危險因素：年齡(95%CI：1.349～5.091)、病理分級(95%CI：1.185～4.605)、臨床分期(95%CI：1.677～6.128)、β-catenin蛋白(95%CI：1.361～5.362)；而患者性別、腫瘤直徑以及初發/復發未提示與預后有關。采用Cox模型多因素綜合評價上述影響因素，將與BUC預后相關有顯著意義的5個因素引入Cox模型，結果顯示：年齡及DAB2IP蛋白是影響BUC患者預后的獨立因素(P<0.05)；而病理分級、臨床分期、β-catenin蛋白并非為影響BUC患者預后的獨立因素(P>0.05，表4、5)。

表4 膀胱尿路上皮癌患者預后單因素Cox模型分析

表5 膀胱尿路上皮癌患者預后多因素Cox回歸模型分析

2.5 隨訪 采用電話進行隨訪，以患者死亡、2015年12月31日或失訪作為隨訪結束，隨訪時間為12～84個月。失訪12例，失訪率為11.5%。

3 討論

人類DAB2IP定位于9q33.1～9q33.3，包含15個外顯子和14個內含子，編碼967個氨基酸，相對分子質量為11.0×104[5]。2002年，Chen等[5]利用酵母雙雜交系統鑒定發現：DAB2IP是一種新的Ras-GTP酶激活蛋白，可作為效應蛋白與卵巢癌差異表達基因2(differentially expressed in ovarian carcinoma-2, DOC2, 又稱DAB2)[6]的氨基末端相互作用，從而激活DAB2的表達，抑制多種腫瘤的發生及發展[7-8]。且DAB2IP基因是與腫瘤相關的信號轉導通路中的重要環節，介導PI3K-AKT、MAEK /ERK、NF-kB、ASK1-JNK、GSK-3β-β-catenin、STAT3/Twist1/P-glycoprotein等多個信號通路[9-10]。目前研究表明DAB2IP在腫瘤發生、發展過程中其表達受到抑制，引起該表達下調的主要機制是DAB2IP基因啟動子區域的DNA發生高度甲基化使DAB2IP基因表達受到抑制[11]。DAB2IP基因作為一種最新發現的抑癌基因，在膀胱癌中的表達與臨床預后的關系，目前鮮有報道。

本組實驗結果顯示，104例BUC組織和40例癌旁正常膀胱黏膜組織中DAB2IP陽性率分別42.30%(44/104)、90%(36/40)，兩者差異有顯著性(P<0.05)。DAB2IP蛋白表達與BUC的病理組織學分級、臨床病理分期有關(P<0.05)，并且隨病理分級及臨床分期提升而陽性率降低。生存分析結果示：DAB2IP是影響BUC患者預后的獨立因素，陽性組預后好于陰性組。上述實驗結果與Shen等[12]報道一致,均提示DAB2IP表達下調在BUC的發生、發展及預后中起著重要作用。

β-catenin蛋白由CTNNB1基因編碼，該基因定位于人類染色體3p21，由16個外顯子組成，全長23.2 kb[13]。β-catenin是Wnt信號傳導通路及介導細胞黏附的關鍵分子，在生理情況下，β-catenin通過破壞包含APC腫瘤抑制基因等復合物保持低的胞質濃度[14]。然而，當Wnt信號通路被激活，β-catenin積累在細胞質和胞核，導致細胞增殖、侵襲和轉移。多項研究表明，β-catenin與腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移有關[15-16]。本組結果表明，β-catenin在BUC中陽性率明顯高于正常膀胱黏膜組織，與BUC患者年齡、病理組織學分級、臨床病理分期及腫瘤直徑有關(P<0.05)，并且隨病理分級及臨床分期提升而陽性率升高，與性別以及初發/復發情況無關(P>0.05)。生存分析結果示：β-catenin陰性組預后好于陽性組。因此，作者認為β-catenin蛋白異常表達參與BUC的發生、發展及預后過程。

Xie等[4]在前列腺癌中發現，DAB2IP能調節GSK-3β-β-catenin信號通路，并且與EMT有關。在DAB2IP存在的情況下，其C2結構域可與蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A, PP2A)和GSK-3β相互作用，使GSK-3β活化，進而使β-catenin轉錄活性下降，抑制了GSK-3β-β-catenin信號通路。而β-catenin在EMT中起到雙重作用，在DAB2IP沉默后，β-catenin的細胞核內積累增加，并促進其在細胞質中的降解，調節β-catenin在質核的動態平衡，誘導EMT，提高腫瘤細胞的遷移及侵襲能力。本組實驗發現BUC組織中DAB2IP表達下調，β-catenin表達升高，且兩者表達呈負相關(r=-0.330，P<0.05)，提示兩者通過GSK-3β-β-catenin信號通路在BUC的發生、發展中發揮重要作用。

綜上所述，DAB2IP和β-catenin異常表達與BUC病理組織學分級、臨床病理分期及預后密切有關，聯合檢測兩者有助于對BUC的診治提供新的思路和線索。

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Expression of DAB2IP and β-catenin in bladder urothelial carcinoma and their clinical significance

ZHENG Lin-feng, NI Xing-hao, CHENG Guo-ping, YANG Shi-feng
(DepartmentofPathology,ZhejiangCancerHospital,Hangzhou310022,China)

Purpose To investigate the clinical utility of DAB2IP (DOC-2/DAB2 interactive protein)and β-catenin expression in bladder urothelial carcinoma (BUC). Methods The expression of DAB2IP and β-catenin was detected in 104 BUC cases and 40 peritumorial tissues using EnVision two-step immunohistochemical method, and the association with BUC clinicopathological parameters was analyzed. Results The expression of DAB2IP in BUC was significantly less than that of peritumorial normal tissues, and the expression of β-catenin in BUS was significantly higher than that of peritumorial normal tissues (P<0.05). DAB2IP expression and histologic grading, clinical pathologic staging and 5 years survival rate had statistical significance (P<0.05). No statistical significance with gender, age, tumor diameter and in patients with incipient/recurrence. β-catenin expression and age, histologic grading, clinical pathologic staging, tumor diameter and 5 years survival rate have statistical significance (P<0.05). No statistical significance correlated with gender and in patients with incipient/recurrence, DAB2IP and β-catenin expression in BUC are negatively correlated (P<0.05). Conclusion In bladder urothelial carcinoma, down-regulation of DAB2IP and up-regulation of β-catenin, are in a negative correlation. Abnormal expression of DAB2IP and β-catenin is correlated with histologic grading, clinical pathologic staging and prognosis.

bladder neoplasms; urothelial carcinoma; DAB2IP; β-catenin; immunohistochemistry

浙江省腫瘤醫院病理科，杭州 310022

鄭林峰，男，主治醫師。E-mail: zhenglf@zjcc.org.cn 倪型灝，男，主任醫師，通訊作者。Tel:(0571)88122269

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.010.html

R 737.14

A

1001-7399(2017)04-0398-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.010

接受日期：2017-02-20