涎腺腺樣囊性癌組織中HPV感染及p53、p16、EGFR、Cdc2蛋白表達與預后的關系

孫玉滿，吳 蒙，韓鳳艷，劉宏俠，楊俊泉，汪宏斌

涎腺腺樣囊性癌組織中HPV感染及p53、p16、EGFR、Cdc2蛋白表達與預后的關系

孫玉滿1，吳 蒙2，韓鳳艷1，劉宏俠1，楊俊泉3，汪宏斌3

目的 初步探討HPV感染及p53、p16、EGFR及Cdc2表達與涎腺腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)預后的關系。方法 收集76例涎腺ACC手術標本，分別采用PCR-DNA反向點雜交及免疫組化SP法檢測腫瘤組織中HPV-DNA及p53、p16、EGFR及Cdc2表達，收集臨床資料并隨訪。Kaplan-Meier模型分析患者生存情況，Log-rank檢驗比較生存曲線，多因素Cox回歸模型進行預后分析。結果 涎腺ACC組織中HPV感染率為0(0/76)。p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白在腫瘤組織中的陽性率分別為76.3%(58/76)、57.9%(44/76)、60.5%(46/76)及64.5%(49/76)。p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、TNM分期及病理類型無關(P均>0.05)。EGFR陽性患者中位總生存期(overall survival, OS)低于陰性患者(χ2=19.111，P<0.01)。EGFR陽性患者中位無進展生存期(progression-free survival, PFS)低于陰性患者(χ2=6.621，P<0.01)。Cdc2陽性患者中位OS短于陰性患者(χ2=3.870，P<0.05)。Cdc2陽性患者中位PFS低于陰性患者(χ2=6.755，P<0.01)。多因素Cox回歸模型分析顯示EGFR、Cdc2蛋白表達(RR=13.417、13.075，P均<0.001)是涎腺ACC患者預后的獨立危險因素。結論 涎腺ACC組織中未檢測出HPV感染。p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白在涎腺ACC組織中呈不同程度表達，p16不能作為涎腺ACC患者HPV感染狀態的替代指標。EGFR及Cdc2陽性表達是涎腺ACC患者預后的獨立危險因素，臨床對EGFR及Cdc2蛋白表達患者應密切隨訪。

涎腺腫瘤；腺樣囊性癌；HPV；EGFR；Cdc2；預后

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)是一種好發于涎腺的惡性腫瘤，屬頭頸部惡性腫瘤中相對少見的一種類型。其在腮腺的發病率約為10%，小涎腺的發病率約為30%[1]。組織學上， ACC具有局部生長迅速，神經浸潤、遠處轉移及復發率高的特點，臨床治療難度大。因此，探尋ACC復發和預后因素對腫瘤的治療有一定的指導意義。近年來病毒感染已成為公認的引起人類頭頸部腫瘤的發生因素，如人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus, HPV)和EB病毒等[2]。HPV感染可以在多個部位，如子宮頸、口腔可引起鱗狀細胞腫瘤，而HPV在涎腺腫瘤的發生、發展過程中所起的作用仍值得商榷。本文旨在評價HPV感染與p16、p53、EGFR及Cdc2之間的關聯以確定這些因素與涎腺ACC發生、發展及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集唐山市協和醫院2004年1月1日～2013年12月31日手術切除的76例ACC組織，其中腫瘤位于腮腺者26例，頜下腺24例，腭部20例，舌下腺6例。臨床資料較完整，所有切片均經兩位高級職稱病理醫師復核。標本均完成HPV-DNA及p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白免疫組化檢測。76例患者中，男性40例，女性36例；年齡41～70歲，中位年齡51歲；根據第6版AJCC標準進行臨床分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期15例，Ⅲ期19例，Ⅳ期36例。組織學類型包括實體型、篩狀型、管狀型。

1.2 檢測設備與試劑 PCR-DNA反向點雜交所用檢測儀器及HPV基因分型檢測試劑盒均購自深圳亞能生物公司。p53單抗Do-1、鼠抗人p16ink4單抗ABM51100-10、鼠抗人EGFR單抗：AM093、鼠抗人Cdc2單抗：C-9及SP免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋公司。4種抗體工作濃度均為1 ∶100。

1.3 隨訪 全部病例進行門診或電話隨訪，隨訪時間為6個月～9年6個月，隨訪截止至2015年12月31日，隨訪率為100%。

1.4 方法

1.4.1 PCR-DNA反向點雜交 應用HPV核酸檢測試劑盒進行點雜交。取石蠟包埋涎腺腫瘤組織標本，按試劑盒操作說明進行HPV-DNA提取、PCR擴增、雜交、洗膜和顯色。結果判讀：陽性質控品雜交膜條在相應的HPV基因型位點及IC位點出現顯色信號(藍色斑點)，其它位點不顯色；陰性質控品雜交膜條除IC位點出現顯色信號外，其它位點不顯色。按照膜條上探針排列順序，依據顯色信號的有無判讀結果，依據顯色信號的位置判定HPV基因型。

1.4.2 免疫組化 標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，行HE及免疫組化染色，SP法檢測p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白表達。用已知p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白表達陽性標本作陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。p53蛋白定位于細胞核；EGFR蛋白主要定位于細胞膜和胞質，陽性細胞呈散在或片狀分布。p16、Cdc2蛋白陽性部位在細胞核和(或)細胞質內，單獨胞質不視為陽性。觀察染色切片中10個具有代表性的高倍視野，染色為棕黃色視為陽性細胞。陽性細胞數≥10%定為陽性，<10%或無著色者定為陰性。

1.5 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，HPV感染及p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白表達與臨床病理指標采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；生存分析采用Kaplan-Meier生存分析，多因素分析用Cox回歸模型進行。所有數據均采用雙側檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 涎腺ACC組織中HPV感染及p53、p16、EGFR及Cdc2表達 PCR-DNA反向點雜交檢測結果顯示：涎腺ACC組織中HPV感染率為0(0/76)；免疫組化結果顯示：ACC組織中p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白陽性率分別為76.3%(58/76)、57.9%(44/76)、60.5%(46/76)及64.5%(49/76)(圖1)。χ2檢驗顯示，p53、p16、EGFR及Cdc2表達與涎腺ACC患者性別、年齡、腫瘤部位、TNM分期及病理類型無明顯相關性(表1)。

2.2 涎腺ACC組織中p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白表達與預后的關系 截止隨訪至2015年12月31日，有18例患者死亡，總病死率為23.7%(18/76)。全組患者中位總生存期(overall survival, OS)為63個月，5年存活率為57.9%(44/76)。Kaplan-Meier生存分析顯示：p53表達與患者中位OS差異無統計學意義(χ2=0.009，P=0.924)；p16表達與患者中位OS差異無統計學意義(χ2=0.561，P=0.454)；EGFR陽性患者中位OS為61個月，低于陰性患者的75個月(圖2)。Cdc2陽性患者中位OS為53個月，低于陰性患者的69個月(圖3)。中位OS與患者性別、年齡、TNM分期、腫瘤部位、病理類型差異無統計學意義。全組患者中位無進展生存期(progression-free survival, PFS)為40個月，p53表達與患者中位PFS差異無統計學意義(χ2=0.561，P=0.454)；p16表達與患者中位PFS差異無統計學意義(χ2=0.400，P=0.527)；EGFR陽性患者中位PFS為36個月，低于陰性患者的46個月(圖4)。Cdc2陽性患者中位PFS為36個月，低于陰性患者的50個月(圖5)。中位PFS與患者性別、年齡、TNM分期、腫瘤部位、病理類型差異無統計學意義。多因素Cox回歸模型分析顯示：EGFR與Cdc2陽性是涎腺ACC患者預后的獨立危險因素(RR=13.417、13.075，P均<0.001，表2)。p53、p16表達情況并未顯示出與生存率有關。

表1 涎腺腺樣囊性癌中p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白表達與臨床病理特征的關系

ABCD

圖1 A. 腺樣囊性癌組織中EGFR陽性；B.腺樣囊性癌組織中Cdc2陽性；C.腺樣囊性癌組織中p53陽性；D.腺樣囊性癌組織中p16陽性，SP法

圖2 腺樣囊腺癌組織中EGFR表達與患者總生存期的關系

圖3 腺樣囊腺癌組織中Cdc2表達與患者總生存期的關系

圖4 腺樣囊腺癌組織中EGFR表達與患者無進展生存期的關系

圖5 腺樣囊腺癌組織中Cdc2表達與患者無進展生存期的關系

3 討論

ACC是起源于腺體導管的惡性腫瘤，組織學類型以篩狀、管狀、實性的生長方式為主，伴有多少不等的黏液及粉染基膜樣物質，腫瘤細胞內襯導管上皮和肌上皮的分化特點，易出現神經侵犯及轉移，預后不佳，探尋影響其預后因素的研究一直備受臨床關注。2012年國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer, IARC)調查數據顯示，由HPV誘發的頭頸癌發生率逐年增加，特別是口腔頜面部腫瘤[3]。目前HPV在涎腺惡性腫瘤發病及預后的研究尚少，研究結果也并不一致。Boland等[4]采用原位雜交法檢測ACC標本時發現無1例HPV陽性病例。Justin等[5]亦發現鼻腔鼻竇外的ACC組織中HPV檢測呈陰性。Hühns等[2]的研究結果顯示17例ACC標本中有4例HPV16陽性，陽性率為25%。國內霍真等[6]采用原位雜交法檢測27例肺ACC標本發現HPV均陰性。本組實驗發現，在76例涎腺ACC組織中未檢出HPV感染，提示發生在涎腺的ACC與HPV感染可能無關。

表2 涎腺腺樣囊性癌患者的多因素Cox回歸模型預后分析

在以往的臨床經驗中，p16蛋白在多種頭頸部腫瘤組織中已作為HPV感染狀態的替代指標，但在ACC組織中的評價作用一直備受爭議。Isayeva等[7]報道p16在ACC中的陽性率為64%。Lassen等[8]在研究丹麥人咽及聲門上癌的試驗中發現，p16陽性率為22%并與HPV感染密切相關。p16陽性患者較陰性患者有較高的5年腫瘤局部控制率(58% ∶28%，P=0.000 5)、疾病特異性生存率(72% ∶34%，P=0.000 6)及總生存率(62% ∶26%，P=0.000 3)。Xing等[9]報道外陰和子宮頸的ACC組織中高危型HPV感染與p16蛋白表達之間并無關聯。Boland等[4]亦證實以檢測p16的方法來代替HPV檢測在ACC組織中并不適用。本組實驗發現p16在76例涎腺ACC組織中的陽性率為57.9%(44/76)，但無1例HPV感染，推測兩者之間并無關聯。因此在涎腺ACC組織中p16表達并不能作為HPV狀態的替代指標。

由HPV誘發的腫瘤多與野生型p53腫瘤抑制基因有關。野生型p53蛋白在體內的半衰期短，免疫組化法無法檢測到，而突變型p53蛋白的半衰期長，可通過免疫組化法檢出。因此，在HPV導致的腫瘤組織中p53蛋白的表達多呈陰性。文獻關于p53在ACC組織中的陽性率報道不一。Jiang等[10]研究發現p53在腮腺ACC組織中的陽性率為45.7%，但與患者生存期無關。Huo等[11]報道在肺ACC組織中p53陰性。本組實驗發現，p53在涎腺ACC組織中的陽性率為76.3%，p53陽性患者生存期短于陰性患者，但差異無統計學意義，其對ACC患者預后評價的作用有待進一步擴大樣本量進一步研究證實。

EGFR參與許多人類惡性腫瘤的發生、發展，在腫瘤生長和轉移過程中起重要作用。不同類型的涎腺惡性腫瘤中EGFR基因拷貝數或蛋白陽性率并不一致。Wang等[12]研究發現，在ACC組織中EGFR表達明顯增加，且在篩狀及管狀兩種組織類型中的陽性率高于實體型。本組實驗結果顯示EGFR在涎腺ACC中的陽性率為60.5%，在Ⅰ期和Ⅱ期腫瘤組織中的陽性率低于Ⅲ期和Ⅳ期組織，但差異無統計學意義，尚需增加樣本量進一步驗證。經多因素Cox回歸模型分析顯示EGFR蛋白表達與生存期短有關，是影響涎腺ACC患者預后的獨立因素。

Cdc2是調控細胞周期的重要激酶，其主要作用是在G2/M檢驗點檢查DNA紡錘體中微管的組裝及著絲點位置的正確連接，Cdc2表達異常可直接導致細胞分化障礙、誘導細胞異常轉化進而促進腫瘤發生[13]。有文獻報道Cdc2蛋白已在多種頭頸部惡性腫瘤組織中出現過表達，如喉癌[14]、舌鱗癌[15]等。孫玉滿等[16]研究發現Cdc2在喉癌組織中的陽性率為70.6%，明顯高于癌旁陰性切緣組織，且Cdc2在切緣組織中陽性的患者術后復發率明顯高于陰性患者。但其在涎腺組織中的表達情況尚無報道。本組實驗顯示，Cdc2蛋白在涎腺ACC組織中的陽性率高達64.5%(49/76)，單因素Cox回歸模型分析顯示Cdc2陽性患者較陰性患者的中位OS短24個月(P=0.001)，多因素Cox回歸模型分析提示Cdc2陽性表達與ACC生存期短有關，是影響患者預后的獨立因素。

綜上，本組實驗中涎腺ACC組織中未檢測出HPV感染。p53、p16、EGFR及Cdc2蛋白在多數ACC組織中均有表達，但p16不能作為涎腺ACC患者HPV感染狀態的替代指標。EGFR及Cdc2陽性患者預后差于陰性患者，臨床對上述兩種蛋白陽性的患者應密切隨訪。

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Correlation of HPV infection and expression of p53, p16, EGFR and Cdc2 with prognosis in salivary adenoid cystic carcinoma

SUN Yu-man1, WU Meng2, HAN Feng-yan1, LIU Hong-xia1, YANG Jun-quan3, WANG Hong-bin3
(1DepartmentofPathology,TangshanXieheHospital,Tangshan063004,China;2DepartmentofBasicMedicine,PathologicalTeachingandResearchingSection,TangshanVocationalandTechnicalCollege,Tangshan063004,China;3DepartmentofRadio-chemotherapyOncology,TangshanPeople’sHospital,Tangshan063001,China)

Purpose To investigate the relationship between HPV infection and p53, p16, EGFR expression and prognosis in patients with salivary adenoid cystic carcinoma (ACC). Methods Totally 76 cases of adenoid cystic carcinoma specimens were selected, PCR-reverse dot blot hybridization was used to detect infection of HPV and SP immunohistochemical method was adopted to detect the expression of p53, p16, EGFR, Cdc2 in tumor tissues. Clinical data were collected and all the patients were followed up. The Kaplan-Meier method was used to estimate median overall survival and the Log-rank test to compare survival curves. Cox regression model was used for multivariate analyses. Results Infection rate of HPV in adenoid cystic carcinoma tissues was 0(0/76). The expression rate of p53, p16, EGFR, Cdc2 protein in adenoid cystic carcinoma tissues were 76.3%(58/76), 57.9%(44/76), 60.5% (46/76)and 64.5% (49/76)respectively. There was no correlation of the expression of p53, p16, EGFR and Cdc2 with gender, age, tumor location, TNM stage and histological type of patient. Kaplan-Meier survival analysis showed that EGFR-positive patients had shorter median overall survival rate (OS) than the negative ones (χ2=19.111,P<0.001). EGFR-positive patients had shorter median progression-free survival rate(PFS)than the negative ones (χ2=6.621,P<0.01). Cdc2 positive patients had shorter median OS than the negative ones (χ2=3.870,P<0.05). Cdc2 positive patients had shorter median PFS than the negative ones (χ2=6.755,P<0.01). Cox regression analysis showed that expression of EGFR and Cdc2 was independent risk factors for the prognosis of patients with salivary gland ACC (relative risk=13.417, 13.075,P<0.001). Conclusion There is no HPV infection detected in adenoid cystic carcinoma tissues. p53, p16, EGFR and Cdc2 are positively expressed in most salivary adenoid cystic carcinoma. p16 is unsuitable as a surrogate for HPV infection status of patient with ACC. Expression of EGFR and Cdc2 is independent risk factors in the prognosis of patients with salivary gland ACC. For the EGFR or Cdc2 positive patients should be followed up closely.

salivary neoplasms; adenoid cystic carcinoma; HPV; EGFR; Cdc2; prognosis

1河北省唐山市協和醫院病理科，唐山 0630042唐山職業技術學院基礎醫學部病理學教研室，唐山 063004

3河北省唐山市人民醫院放化療科，唐山 063001

孫玉滿，男，副主任醫師。E-mail: symts@163.com 劉宏俠，女，碩士，主任醫師，碩士生導師，通訊作者。 E-mail: lhx1lmq@126.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.009.html

R 739.87

A

1001-7399(2017)04-0393-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.009

接受日期：2017-02-10