MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白在結直腸癌中的表達及在Lynch綜合征篩查中的意義

李 惠，孫 怡，劉春樣，趙蘇蘇，韓 梅，陳 劼，錢曉萍

MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白在結直腸癌中的表達及在Lynch綜合征篩查中的意義

李 惠1，孫 怡1，劉春樣1，趙蘇蘇1，韓 梅1，陳 劼1，錢曉萍2

目的 探討錯配修復(mismatch repair, MMR)蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2在結直腸癌中的表達及其臨床意義。方法 采用免疫組化EnVision兩步法檢測102例結直腸癌組織中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白表達缺失情況，分析蛋白表達缺失與結直腸癌臨床病理特征的關系，并對其中20例進行微衛星不穩定(microsatellite instability, MSI)檢測。結果 102例結直腸癌有15例(14.7%)發生MMR蛋白表達缺失，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達缺失率分別為12.7%(13/102)、3.9%(4/102)、4.9%(5/102)、10.8%(11/102)。結直腸癌標本中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的蛋白表達缺失與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移無關(P>0.05)；MLH1與PMS2蛋白表達缺失與組織學分化高低相關(P<0.05)。進行MSI檢測的10例MMR蛋白缺失病例中有2例(2.0%)為高頻微衛星不穩定(microsatellite instability-high, MSI-H)，其余8例為微衛星穩定(microsatellite stability, MSS)；另10例無MMR蛋白缺失的病例微衛星狀態均為低頻微衛星不穩定(microsatellite instability-low, MSI-L)/MSS。結論 免疫組化檢測MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的缺失可以用于Lynch綜合征的初篩，對結直腸癌患者行MMR免疫組化檢測和MSI聯合檢測可提高Lynch綜合征的診斷率。

結直腸腫瘤；錯配修復基因；Lynch綜合征；免疫組織化學

結直腸癌發病率及病死率逐年升高，已成為位居全球男性第3位、女性第2位的高發惡性腫瘤。大部分結直腸癌是散發的，在臨床工作中，年輕的結直腸癌患者需要排除遺傳性結直腸癌。Lynch綜合征是錯配修復(mismatch repair, MMR)基因(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)胚系突變導致的遺傳性結直腸癌，MMR蛋白突變者發生結直腸癌的幾率為50%～80%[1]。研究顯示美國的結直腸癌患者中2.8%確診為Lynch綜合征[2]，不同研究顯示結直腸癌人群中Lynch綜合征比例變化很大(0.5%～13%)[3]。其發病機制和病死率區別于散發性結直腸癌，早期發現對治療和預防有重大意義。然而Lynch綜合征目前在國內尚未受到重視，日常的篩查工作尚未普及，導致許多Lynch綜合征被歸入散發性結直腸癌中。本文按照Lynch綜合征的診斷流程，探討國內Lynch綜合征在結直腸癌中的發病率和MLH1、MSH2、MSH6和PMS2在結直腸癌中的表達及其在Lynch綜合征篩查中的意義，為Lynch綜合征的早期診斷提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2014年2月～2015年8月南京中醫藥大學附屬醫院病理科存檔的102例結直腸癌石蠟包埋標本，所有病例均經兩位病理醫師確診為腺癌。其中男性65例，女性37例，年齡23～90歲，中位年齡60歲。左半結腸癌32例，右半結腸癌29例，直腸癌41例。36例高分化，40例中分化，26例低分化。34例有淋巴結轉移，68例無淋巴結轉移。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 標本均經10%中性緩沖福爾馬林固定，常規脫水、石蠟包埋，3～4 μm厚切片，烤片后脫蠟，梯度乙醇脫水，采用免疫組化EnVision兩步法檢測MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白表達，所有抗體均購自福州邁新公司，用PBS液代替一抗作陰性對照。陽性染色定位于細胞核。

1.2.2 微衛星不穩定分析(microsatellite instability, MSI)檢測 腫瘤組織蠟塊切片，HE染色，選取腫瘤細胞，Qiagen公司試劑盒提取基因組DNA備用。同時提取患者相應的血液基因組DNA備用。以Lynch綜合征國際合作組織統一推薦的5個微衛星檢測位點：BAT26、BAT25、D2S123、D5S346和D17S250進行引物設計，由LifeTech公司合成標記,運用多重熒光PCR技術進行微衛星位點的擴增。反應體系為：15 μL TrueAllele PCR反應混合液，4 μL上、下游引物，1 μL基因組DNA。PCR循環條件：95 ℃預變性15 min，94 ℃變性60 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃充分延伸25 min，共30個循環。ABI 3500型基因分析儀對PCR產物進行比對，GeneMapper軟件分析數據。

1.2.3 BRAF基因突變檢測 常規提取、純化DNA，PCR擴增后用3100-Avant遺傳分析儀進行測序，Data Collection軟件自動進行數據處理和分析。測序中若發現突變病例，需用反向引物進行反向測序驗證。DNA Sequencing Analysis 5.1軟件分析獲取測序電泳圖和序列。將樣品序列用ABI SeqScape軟件與Genebank標準序列進行比對，觀察樣本序列有無突變。

1.3 Lynch綜合征的篩查 Lynch綜合征的篩查流程詳見圖1。

1.4 統計學分析 所有數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。定性資料的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行顯著性檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

圖1 Lynch綜合征的篩查流程

2 結果

2.1 結直腸癌組織中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白免疫組化表達缺失率 對102例結直腸癌組織進行MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白免疫組化檢測。15例(14.7%)發生MMR蛋白表達缺失(圖2))，其中8例為MLH1和PMS2蛋白表達缺失(男性7例，女性1例)，中位年齡52歲；1例為MLH1、MSH2和MSH6蛋白表達缺失(女性)；1例為MLH1、MSH2和PMS2蛋白表達缺失(女性)；1例為MLH1蛋白表達缺失(男性)；2例為MSH6蛋白表達缺失(男性)；2例發生上述4種蛋白共同表達缺失(男女性各1例)，中位年齡45歲。MLH1蛋白表達缺失率為12.7%(13/102)；MSH2蛋白表達缺失率為3.9%(4/102)；MSH6蛋白表達缺失率為4.9%(5/102)；PMS2蛋白表達缺失率為10.8%(11/102)。MLH1和PMS2蛋白表達共同缺失率為10.8%(11/102)，PMS2表達缺失的標本同時均伴有MLH1蛋白表達缺失。2例(2.0%)MSH6表達缺失。

MLH1MSH2MSH6PMS2陽性陰性

圖2 結直腸癌組織中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白的表達，EnVision兩步法

2.2 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系 結直腸癌組織中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達缺失與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移無關(P>0.05)，與腫瘤部位相關，右半結腸蛋白表達缺失明顯高于左半結腸和直腸(P<0.05)。MLH1和PMS2的表達缺失與組織學分化相關(P<0.05)。MSH1和PMS2蛋白表達缺失率在低分化腺癌組織中明顯高于中分化腺癌和高分化腺癌(P<0.05，表1)。

表1 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2表達缺失與結直腸癌臨床病理特征的關系

2.3 BRAF基因突變狀態 按照篩查流程，有13例發生MLH1/PMS2蛋白表達缺失的結直腸癌患者進行了BRAF基因第15號外顯子測序分析，發現1例BRAF基因第15號外顯子V600E突變，其余12例BRAF基因第15號外顯子未發現病理性突變。

2.4 MSI檢測結果 隨機抽取20例結直腸癌患者進行了MSI檢測，其中10例發生MMR蛋白表達缺失，另10例無MMR蛋白表達缺失。結果顯示發生MMR蛋白表達缺失的病例中2例腫瘤組織處于高頻微衛星不穩定(microsatellite instability-high, MSI-H)(圖3)，其余8例為微衛星穩定(microsatellite stability, MSS)；無MMR蛋白表達缺失的10例病例顯示均為低頻微衛星不穩定(microsatellite instability-low, MSI-L)/MSS。

圖3 MSI檢測結直腸癌中MMR蛋白表達的缺失A. 血液；B. 腫瘤組織

3 討論

Lynch綜合征是一種常染色體顯性遺傳性疾病，患者發病年齡早，右半結腸多見，常伴有腸外腫瘤如子宮內膜癌、卵巢癌、胃癌、泌尿系統腫瘤、胰腺癌等，組織學特點表現為差分化、黏液樣或印戒細胞樣、髓樣癌生長方式、淋巴細胞浸潤等。早期篩查和干預能有效降低Lynch綜合征的病死率。Lynch綜合征發生于1%～3%的結直腸癌及1%～4%的子宮內膜癌中，日常工作中需對結直腸癌患者進行篩查以鑒別散發性結直腸癌和Lynch綜合征。2004年提出Bethesda修訂標準[4]，指出具有以下情況的患者需進行Lynch綜合征MSI篩查：(1)家族中1名患者50歲前診斷為結直腸癌；(2)發現同時性和異時性多原發結直腸癌和與Lynch綜合征相關的腫瘤患者，不論發病年齡；(3)<60歲診斷的結直腸癌患者曾伴MSI-H；(4)至少1個一級親屬診斷出Lynch綜合征相關腫瘤(其中1例確診年齡<50歲)的家族中發現結直腸癌患者；(5)至少2個一級和二級親屬確診有Lynch綜合征相關腫瘤(不論發病年齡)。而ESMO和NCCN建議對70歲以下結直腸癌患者行Lynch綜合征篩查[5-6]。

Lynch綜合征初篩主要依靠MMR蛋白免疫組化檢測和MSI檢測。MMR蛋白免疫組化檢測包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2，Wan等研究[7]顯示17例可疑Lynch綜合征的結直腸癌患者中4例MLH1表達缺失，5例PMS2表達缺失，MSH2和MSH6各2例表達缺失，表明免疫組化是方便易行且較敏感的初篩方法。彭勇等[8]研究了MLH1、MSH2、PMS2和MSH6蛋白在云南地區Lynch綜合征家系結直腸癌的表達情況，發現4種MMR蛋白總的表達缺失率為84.62%。若出現上述蛋白缺失則提示需進一步行基因檢測排除Lynch綜合征。若上述4種蛋白陽性，則行MSI檢測。MSI檢測包括BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346、D17S250共5個微衛星位點，腫瘤組織與正常對照比較，出現熒光信號移動或數目改變為MSI，如果出現≥2個位點不穩定者為MSI-H，只有1個位點不穩定為MSI-L，無任何位點的變化為MSS。MSI是Lynch綜合征的重要分子標志，研究顯示>95%的Lynch綜合征相關的結直腸癌為MSI-H[9]。當受檢者腫瘤組織中出現MSI-L和MSS時，提示診斷為Lynch綜合征可能性較低。

目前國內對于Lynch綜合征的篩查檢測還未普及，許多臨床醫師尚未充分認識該疾病，MMR蛋白免疫組化檢測尚未納入結直腸癌術后常規檢測項目，事實上只對滿足Bethesda診斷標準的患者進行篩查將會漏診一部分Lynch綜合征患者。2015年美國臨床腫瘤學會遺傳性結直腸癌綜合征臨床實踐指南提出[10]，采用免疫組化篩查結直腸癌標本，當MLH1/PMS2蛋白表達缺失或MSI-H時，需行MLH1甲基化檢測以及BRAF基因V600E突變檢測，兩者均陰性時行MLH1基因測序；當MSH2/MSH6表達缺失時，需行MSH2基因測序；當4種蛋白均表達正常時，建議MSI檢查，并結合家族史行進一步評估。研究顯示BRAF基因突變發生在91%的MSI-H散發性結直腸癌中，而在Lynch綜合征相關結直腸癌中幾乎不發生突變，故BRAF基因突變可排除Lynch綜合征相關結直腸癌[11]。同樣，MLH1啟動子甲基化多與散發性結直腸癌MSI相關，故亦可排除Lynch綜合征[12]。Lynch綜合征最終確診依賴MMR基因突變檢測，國外研究[1]顯示Lynch綜合征中MLH1 (32%)和MSH2(38%)突變占多數，MSH6(14%)和PMS2(15%)突變占少數。

本組實驗中所有確診的結直腸癌患者均行免疫組化初篩檢測，結果顯示102例結直腸癌組織中MMR蛋白缺失率為14.7%(15/102)，與國外研究結果一致(19%)。發生MLH1/PMS2蛋白表達缺失的結直腸癌患者隨后進行了BRAF基因突變檢測，顯示1例突變，提示可排除Lynch綜合征相關性結直腸癌。15例發生MMR蛋白表達缺失的病例中10例進行MSI檢測，其中2例微衛星狀態為MSI-H，高度懷疑Lynch綜合征，建議患者行MLH1和MSH2全基因測序檢測，隨訪發現其中1例并發子宮內膜癌。而本文檢測的未發生MMR蛋白缺失的病例微衛星狀態均為MSI-L/MSS，提示MMR蛋白缺失是Lynch綜合征的重要特征且和微衛星狀態密切相關。MMR蛋白缺失不僅提示Lynch綜合征，還可能成為預測結直腸癌化療療效及預后的指標，對結直腸癌患者進行MMR蛋白表達檢測具有重要意義。2016年美國ASCO年會報告的美國SEER數據庫資料顯示腫瘤部位是Ⅲ/IV期結直腸癌獨立的預后因素，右半結腸相對于左半結腸和直腸死亡風險顯著增高。本組實驗結果顯示MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達缺失與結直腸癌患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移無關(P>0.05)，與腫瘤部位相關，右半結腸蛋白表達缺失明顯高于左半結腸和直腸(P<0.05)，也提示MMR蛋白表達狀態與結直腸癌預后相關。在篩查過程中，由于經濟原因，患者通常更愿意接受免疫組化檢測。免疫組化檢測雖然特異性不如MSI檢測，但費用低廉，更適用于臨床初篩Lynch綜合征患者。而MSI檢測在Lynch綜合征篩查中亦有至關重要的作用，符合Bethesda診斷標準的病例應行MSI檢測。除此以外，MSI檢測還能夠預測結直腸癌化療效果。研究顯示MSS/MSI-L提示對5-FU類化療獲益，但腫瘤較易復發。MSI-H提示患者對5-FU化療獲益受限，生存期預后相對較長[13-14]。

綜上所述，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白缺失在結直腸癌患者中并不少見，提高臨床醫師對Lynch綜合征的認識，積極進行免疫組化初步篩查，提倡對所有結直腸癌患者特別是<60歲患者同時或異時發生結直腸癌和其他惡性腫瘤進行篩查[15]，MMR蛋白免疫組化檢查配合MSI檢測，可以幫助早期發現Lynch綜合征患者及其家系，提高診斷率，早期預防，減少結直腸癌的發病率和病死率。

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Expression of MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 in colorectal cancer and their role in the screening of Lynch syndrome

LI Hui1, SUN Yi1, LIU Chun-yang1, ZHAO Su-su1, HAN Mei1, CHEN Jie1, QIAN Xiao-ping2
(1DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China;2DepartmentofOncology,theAffiliatedHospitalofNanjingUniversity,Nanjing210008,China)

Purpose To investigate the expression of mismatch repair proteins MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 and their clinical significance in colorectal cancer. Methods Immunohistochemical analysis was used to detect MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 protein expression in formalin-fixed paraffin-embedded tissues from 102 colorectal cancer patients, and microsatellite instability (MSI) was tested in 20 cases. The relationship between MMR protein expression and clinical pathological features was also analyzed. Results 15 cases (14.7%) had MMR protein loss. The loss rate of MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 protein was 12.7% (13/102), 3.9% (4/102), 4.9% (5/102) and 10.8% (11/102), respectively. MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 protein losses were not related with gender, age, tumor size, depth of invasion and lymph node metastasis (P>0.05). MLH1 and PMS2 protein losses were related to histological differentiation (P<0.05). MSI was detected in 10 Lynch syndrome candidates. 2 cases (2.0%)of high-frequency microsatellite instability (MSI-H) were identified, and the remaining 8 cases were MSS. However, 10 cases without MMR expression abnormality all showed MSI-L/MSS. Conclusion Immunohistochemical detection of MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 can be used as primary screening for Lynch syndrome and its combination with MSI test can effectively increase the diagnostic rate in Lynch syndrome.

colorectal neoplasms; mismatch repair gene; Lynch syndrome; immunohistochemistry

江蘇省高校優勢學科建設工程資助(012062003010)

1南京中醫藥大學附屬醫院病理科，南京 2100292南京大學附屬鼓樓醫院腫瘤中心，南京 210008

李 惠，女，博士，主治醫師。E-mail: lihui19830401@163.com 錢曉萍，女，博士，主任醫師，通訊作者。E-mail: Qianxiaoping211@hotmail.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.002.html

R 735.3

A

1001-7399(2017)04-0360-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.002

接受日期：2017-02-09