孟魯司特抑制RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞所致炎癥作用研究

江敏時(shí) 檀衛(wèi)平 郭奕文 鄒志浩

孟魯司特抑制RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞所致炎癥作用研究

江敏時(shí) 檀衛(wèi)平 郭奕文 鄒志浩

目的以呼吸道合胞病毒(RSV)感染人支氣管上皮細(xì)胞株(16HBECs)為模型, 探討孟魯司特在抑制炎癥過(guò)程中的藥理作用機(jī)制。方法建立RSV感染的16HBECs的炎癥模型, 給予不同滴度的RSV作用, 收集上清液, 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)兩次檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子的表達(dá)。CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)16HBECs的生長(zhǎng)影響。結(jié)果造模過(guò)程中隨RSV感染滴度的增多, 16HBECs分泌的白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6越多(P＜0.05)；同一感染滴度RSV作用時(shí)間越長(zhǎng),炎癥因子的分泌量持續(xù)升高。12 mg/L及以下藥物濃度的孟魯司特和1∶320及以下稀釋倍的利巴韋林對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有抑制作用。與感染RSV組相比, 高中劑量孟魯司特組較利巴韋林組抑制炎癥因子的作用明顯(P＜0.05)。結(jié)論孟魯司特能抑制RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞所致炎癥作用。

孟魯司特；人支氣管上皮細(xì)胞；呼吸道合胞病毒；炎癥

支氣管哮喘是一種由T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等眾多因素共同介導(dǎo)的呼吸道炎癥疾病。RSV容易感染嬰幼兒、老年人等, 引起毛細(xì)支氣管炎癥和肺炎。孟魯司特是一種選擇性半胱氨酰白三烯受體(CysL1Rs)拮抗劑, 在國(guó)內(nèi)外臨床上都是治療哮喘的首選藥物。有研究發(fā)現(xiàn)孟魯司特具有非CysL1Rs依賴性的更加廣譜的抗炎性, 可作用于免疫活性細(xì)胞如嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等［1］, 其作用機(jī)制不太明確, 更需廣大科研人員的深入研究探討。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備細(xì)胞和病毒：人喉鱗癌上皮細(xì)胞株(HEp-2細(xì)胞)、16HBECs、RSV-Long毒株A2型；藥物和試劑：孟魯司特鈉、利巴韋林注射液(1 ml∶100 mg)。高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清；CCK-8試劑；IL-1β、TNF-α、IL-6、ELISA 試劑盒；設(shè)備：低溫高速離心機(jī)；Thermo酶標(biāo)儀。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 建立RSV感染的16HBECs的炎癥模型Hep-2細(xì)胞、16HBECs生長(zhǎng)培養(yǎng)采用高糖DMEM培養(yǎng)基, 細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境為37℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱下培養(yǎng)。每隔2～3 d傳代一次, 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞試驗(yàn)。

1. 2. 2 RSV 培養(yǎng)及組織培養(yǎng)感染量(TCID50)測(cè)定用Hep-2細(xì)胞對(duì)RSV進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)細(xì)胞病變(cytopathic effect, CPE)總數(shù)達(dá)到80%時(shí)收集細(xì)胞, 于-80℃/37℃的條件中反復(fù)凍融3次, 最后一次凍融盡量最大程度的收集細(xì)胞, 使之釋放病毒。將收集得來(lái)的細(xì)胞懸液在低溫離心機(jī)上2500 r/min, 離心10 min, 收集上清液, 采用0.22 μm濾膜過(guò)濾, 得到病毒懸液,沉淀則棄之。然后分裝后于-80℃保存。按依Reed-Muench兩氏法計(jì)算TCID50。

1. 2. 3 RSV誘導(dǎo)16HBECs炎癥模型的建立不同滴度的病毒的培養(yǎng)基作為RSV 感染組, 設(shè)不含滴度病毒培養(yǎng)基的正常細(xì)胞對(duì)照組。收集12～72 h內(nèi)被感染不同滴度的RSV的16HBECs上清液, 待測(cè)炎癥因子。

1. 2. 4 孟魯司特對(duì)RSV所致16HBECs炎癥的影響CCK-8法檢測(cè)孟魯司特對(duì)細(xì)胞的毒性：細(xì)胞存活率=藥物作用孔的OD值/正常對(duì)照組的OD值。確定各藥物的最大無(wú)毒濃度。ELISA按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 多組比較采用單因素方差分析, 多組組間對(duì)比采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 RSV毒力測(cè)定每50 μl的原液含104.7TCID50, 病毒滴度為104.7TCID50/50 μl。

2. 2 RSV誘導(dǎo)16HBECs炎癥模型的建立隨著RSV感染滴度的增多, IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌量呈上升趨勢(shì)(P＜0.05),隨感染時(shí)間延長(zhǎng), 相同滴度水平下IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌量與12 h相比較也持續(xù)增多(P＜0.05)。

2. 3 孟魯司特對(duì)RSV所致16HBECs炎癥的影響

2. 3. 1 藥物毒性測(cè)定24 mg/L及48 mg/L的孟魯司特、1∶320以上稀釋倍數(shù)利巴韋林對(duì)16HBECs是有一定的抑制作用的, 12 mg/L及以下濃度的孟魯司特、1∶320及以下的稀釋倍數(shù)利巴韋林對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)均無(wú)明顯的抑制作用。

2. 3. 2 孟魯司特對(duì)RSV所致16HBECs炎癥的影響高中低三個(gè)劑量的孟魯司特鈉組、利巴韋林組與模型組比較, 三個(gè)炎癥因子的表達(dá)水平都有顯著的降低(P＜0.05)；高中劑量組分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α的含量比利巴韋林組分泌的量低(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 孟魯司特對(duì)RSV所致16HBECs炎癥因子的影響

表1 孟魯司特對(duì)RSV所致16HBECs炎癥因子的影響

注：與對(duì)照組比較,aP＜0.05；與模型組比較,bP＜0.05；與利巴韋林組比較,cP＜0.05

3 討論

該實(shí)驗(yàn)成功建立了永久性RVS感染人支氣管上皮細(xì)胞的模型并開(kāi)展后續(xù)的研究。有體內(nèi)外研究表明, RSV感染的氣道上皮細(xì)胞分泌高水平的IL-6、IL-1β、IL-8能調(diào)節(jié)刺激正常T細(xì)胞的表達(dá), 調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)以及其他促炎癥因子和趨化因子［2-6］。

孟魯司特是我國(guó)臨床上用于治療小兒支氣管哮喘的指南, 作為一種新型的非甾體類(lèi)抗炎藥, 還具有一系列CysLT1Rs非依賴性的次級(jí)抗炎性, 抑制嗜酸性粒細(xì)胞在氣道血管內(nèi)皮的粘附于遷移活動(dòng)［1,7-9］。孟魯司特單用對(duì)輕度持續(xù)性哮喘小兒有較好的治療效果, 并且副作用小［10-12］。

研究表明, 造模過(guò)程中隨RSV感染滴度的增多, 16HBECs分泌的IL-1β、TNF-α、IL-6越多(P＜0.05)；同一感染滴度RSV作用時(shí)間越長(zhǎng), 炎癥因子的分泌量持續(xù)升高(P＜0.05)。12 mg/L及以下藥物濃度的孟魯司特和1∶320及以下稀釋倍的利巴韋林對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有抑制作用。與感染RSV組相比,高中劑量孟魯司特組較利巴韋林組抑制炎癥因子的作用明顯(P＜0.05)。孟魯司特對(duì)炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6這三個(gè)指標(biāo)都能明顯的改善。但孟魯司特抑制炎癥反應(yīng)機(jī)制目前為止尚未十分明確, 闡明其對(duì)炎癥反應(yīng)的影響對(duì)支氣管哮喘的治療具有深遠(yuǎn)的意義。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.08.074

2017-03-21］

510800 廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(江敏時(shí) 郭奕文鄒志浩)；中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院(檀衛(wèi)平)