以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等干預(yù)視神經(jīng)損傷大鼠視神經(jīng)應(yīng)力松弛特性分析

王 玲,李 鵬,姜 琦

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 眼科，吉林 長春130033;2.吉林大學(xué)南嶺校區(qū) 工程力學(xué)系，吉林 長春130022;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 腎病科，吉林 長春130033)

以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等干預(yù)視神經(jīng)損傷大鼠視神經(jīng)應(yīng)力松弛特性分析

王 玲1,李 鵬2,姜 琦3*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 眼科，吉林 長春130033;2.吉林大學(xué)南嶺校區(qū) 工程力學(xué)系，吉林 長春130022;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 腎病科，吉林 長春130033)

視神經(jīng)損傷是以藥物治療、手術(shù)治療，還是以糖皮質(zhì)激素治療，仍存在著較大的爭議[1]。近期視神經(jīng)損傷以干細(xì)胞移植治療已在動物實驗中取得了一定的進(jìn)展[2]。干細(xì)胞移植治療視神經(jīng)損傷很可能成為一條嶄新的途徑[1]。關(guān)于以人臍血干細(xì)胞hUCBSC(human umbilical cord blood stem cells)干預(yù)治療視神經(jīng)損傷，周丹[3]以人臍血干細(xì)胞干預(yù)治療大鼠外傷性視神經(jīng)部分損傷進(jìn)行了研究，得出了聯(lián)合使用人臍血干細(xì)胞和神經(jīng)營養(yǎng)因子可以促進(jìn)神經(jīng)傳導(dǎo)功能恢復(fù)的作用，神經(jīng)營養(yǎng)因子、人臍血干細(xì)胞、神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合人臍血干細(xì)胞對大鼠外傷性視神經(jīng)部分損傷后視神經(jīng)傳導(dǎo)功能的恢復(fù)具有促進(jìn)作用的結(jié)論。Zhao和Gluckman等[4,5]的研究結(jié)果表明，通過向動物眼玻璃體腔注射hUCBSC 可以在一定程度上起到修復(fù)TON,減緩RGC 進(jìn)行性死亡，減少視功能喪失的作用。李云琴等[1]觀察了以人臍血干細(xì)胞hUCBSC干預(yù)視神經(jīng)損傷動物模型后的效果， 研究發(fā)現(xiàn)，以人臍血干細(xì)胞移植后，對SD 大鼠部分受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞( retinal ganglion cells，RGC) 具有保護(hù)的作用，得出了向視神經(jīng)損傷大鼠玻璃體腔注射hUCBSC 可減緩視網(wǎng)膜中RGC 的凋亡，對RGC 具有一定的保護(hù)作用的結(jié)論。

關(guān)于人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)治療視神經(jīng)損傷動物模型，劉勇等[6]對-綠色熒光蛋白(GFP)基因神經(jīng)干細(xì)胞、轉(zhuǎn)染人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain—derived neurotrophic factor，hBDNF)干預(yù)視神經(jīng)損傷大鼠hBDNF、 GFP在視網(wǎng)膜內(nèi)的存活、遷移和分化情況和對視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)存活的影響進(jìn)行了研究，得出了移植后的hBDNF—GFP—NSCs可少數(shù)可分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞；還可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，移植hBDNF—GFP—NSCs可以增加RGCs的存活數(shù)17的結(jié)論。關(guān)于視神經(jīng)動物模型以藥物治療后的生物力學(xué)實驗研究，Jiang等[7]復(fù)制家兔視神經(jīng)損傷模型，分別以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、以中藥復(fù)光顆粒、重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合中藥復(fù)光顆粒進(jìn)行干預(yù)治療后取各組視神經(jīng)進(jìn)行拉伸實驗，結(jié)果表明，中藥復(fù)光顆粒、重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、中藥復(fù)光顆粒聯(lián)合重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)組拉伸力學(xué)性能指標(biāo)均大于視神經(jīng)損傷模型組，差異顯著(P<0.05).得出了視神經(jīng)損傷模型以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、中藥復(fù)光顆粒、中藥復(fù)光顆粒聯(lián)合重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)治療后，動物視神經(jīng)的拉伸力學(xué)性能指標(biāo)均有一定的恢復(fù)的結(jié)論。對視神經(jīng)損傷動物模型以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、人臍血干細(xì)胞干預(yù)治療后視神經(jīng)的應(yīng)力松弛分析鮮有報道，鑒于視神經(jīng)損傷治療的需要，本實驗分別以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和人臍血干細(xì)胞干預(yù)治療視神經(jīng)損傷動物模型后進(jìn)行應(yīng)力松弛實驗，以應(yīng)力松弛特性指標(biāo)研判人臍血干細(xì)胞、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)治療視神經(jīng)損傷大鼠的療效，旨在為臨床治療視神經(jīng)損傷提供應(yīng)力松弛力學(xué)特性參數(shù)。

1 材料與方法

實驗大鼠：6月齡雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量320-330 g，購于吉林大學(xué)實驗動物部。實驗前通過腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg麻醉大鼠，檢查大鼠外眼及眼底有無病變，對無病變大鼠納入實驗。動物飼養(yǎng)室溫度22-25℃，自然光照，每天光照12小時，室內(nèi)空氣流通，相對濕度58-71%，大鼠在籠中自由攝食飲水。60只大鼠隨機(jī)分為視神經(jīng)損傷以BDNF干預(yù)組20只，視神經(jīng)損傷模型組20只、視神經(jīng)損傷模型以人hUCBSC干預(yù)組20只，在各組大鼠中隨機(jī)取20只大鼠正常眼(右眼)為正常對照組。

藥物：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，上海酶聯(lián)生物科技有限公司(上海，中國)人臍血干細(xì)胞(hUCBSC)，深圳北科生物公司生產(chǎn)(深圳，廣東省，中國)。

大鼠視神經(jīng)損傷模型的復(fù)制：按參考文獻(xiàn)[7]的方法復(fù)制大鼠視神經(jīng)損傷模型，將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺上,向大鼠腹腔內(nèi)注射0.1%的烏拉坦(5 mg/kg)水合氯醛麻醉大鼠,之后將大鼠左眼頂側(cè)眶上皮膚切開，露出頂側(cè)眶、眶壁和眶上緣切跡頂側(cè)眶,切除眶上緣切跡兩側(cè)部分眶壁骨板(寬5 mm，深7-8 mm),將后部眼球筋膜剪開,沿上直肌向球后鈍性分離,暴露眼球后視神經(jīng)。在離后極部約3 mm，游離視神經(jīng)約5 mm,用相當(dāng)于98 g恒定壓力的反向血管夾(型號：W40160，規(guī)格：3.7 cm；上海醫(yī)療器械廠(上海，中國) 鉗夾同一部位的視神經(jīng)5 s。術(shù)野用慶大霉素液沖洗5次后，以,青島耐克醫(yī)材有限公司(青島，山東省，中國)生產(chǎn)的10-0號尼龍線分層縫合。造模后立即觀察,對光反射消失,傷眼瞳孔散大，視網(wǎng)膜血管無出血或梗塞大鼠作為造模成功的動物納入實驗。

藥物干預(yù)：對視神經(jīng)損傷大鼠以人臍血干細(xì)胞(hUCBSC)干預(yù)組大鼠于造模7天后，用注射器向大鼠玻璃體內(nèi)一次性注射hUCBSC106個[7]。對視神經(jīng)損傷模型以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)干預(yù)組大鼠于造模7天后[7]，用注射器向大鼠玻璃體內(nèi)一次性注射BDNF50 ng。

各組大鼠視覺電生理檢測：各組大鼠于造模后即刻和造模30d后以REFZ-POZE21sompace型視覺電生理儀(德國、慕尼黑)檢測各組大鼠的閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)指標(biāo)，參考電極置于額部正中，記錄電極放于枕骨結(jié)節(jié)上1.5-2.0 cm處，將參考皮膚電極放置在眼眶顳側(cè)，將接地電極放置在耳垂；將角膜接觸鏡電極放好，電極放好后開始刺激，閃光照度2 擋，60lx，頻率2Hz，分析時間250 ms。

各組大鼠視覺電生理檢測完成后，以耳緣靜脈注氣法處死各組大鼠，使視神經(jīng)暴露，在蘇州六六科技股份有限公司(蘇州，江蘇省，中國)生產(chǎn)的YZ6F直接檢眼鏡下以手術(shù)刀切取大鼠眶內(nèi)段同一部位視神經(jīng)，放在裝有生理鹽水的容器內(nèi)，存放于4℃冰箱內(nèi)。

大鼠視神經(jīng)試樣應(yīng)力松弛實驗： 以CCs-3型讀數(shù)顯微鏡(長春市第三光學(xué)儀器廠)測量視神經(jīng)試樣的幾何尺寸，試樣長度為10 ±0.1 mm，視神經(jīng)損傷模型以hUCBSC干預(yù)組試樣直徑0.79-0.82 mm、正常對照組試樣直徑0.78-0.82 mm，視神經(jīng)損傷模型組試樣直徑0.76-0.81 mm、 視神經(jīng)損傷模型以BDNF干預(yù)組試樣直徑00.780-81 mm mm。按參考文獻(xiàn)[8]的方法分別對每個試樣進(jìn)行預(yù)調(diào)處理后待用。應(yīng)力松弛實驗溫度設(shè)定為36.5±1.0℃，將試樣裝夾在MODEL55100型電子萬能試驗機(jī)(長春試驗機(jī)研究所生產(chǎn))的夾具內(nèi)，以60%/min的速度對試樣進(jìn)行應(yīng)力松弛實驗，當(dāng)各組大鼠視神經(jīng)試樣應(yīng)力為0.386 Mpa，視神經(jīng)損傷模型組試樣應(yīng)變?yōu)?.86%、正常對照組試樣應(yīng)變?yōu)?.14%、視神經(jīng)損傷模型以BDNF干預(yù)組試樣應(yīng)變?yōu)?.94%、視神經(jīng)損傷模型以hUCBSC干預(yù)組試樣應(yīng)變?yōu)?.06%時保持應(yīng)變恒定，應(yīng)力松弛實驗時間為7 200 s。達(dá)到7 200 s時，計算機(jī)自動輸出應(yīng)力松弛實驗結(jié)果。實驗中不斷的向試樣淋生理鹽水，以使試樣保持濕度。

統(tǒng)計學(xué)分析方法：以美國SPSS16.0 軟件包(SPSS,Chicago,IL,USA)對視神經(jīng)試樣應(yīng)力松弛實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以mean±SD表示，采用Sceffe法和單因素方差分析法比較組間數(shù)據(jù)差異，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)檢測結(jié)果

各組大鼠視神經(jīng)閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)檢測結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠視神經(jīng)閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)檢測結(jié)果(n=20)

注:造模30天后各組比較：與模型組比較aP<0.05,與hUCBSC干預(yù)組比較，bP<0.05。

F- VEP 記錄 圖形分析標(biāo)準(zhǔn): P1 波幅值為自N1 波谷底至P1 波峰頂,潛伏期為自觸發(fā)時至P1峰為止。

2.2 以計算機(jī)擬合的視神經(jīng)試樣應(yīng)力松弛實驗曲線

以計算機(jī)擬合的視神經(jīng)試樣應(yīng)力松弛實驗曲線見圖1.

圖1 以計算機(jī)擬合的大鼠視神經(jīng)應(yīng)力松弛實驗曲線

視神經(jīng)應(yīng)力松弛實驗結(jié)果顯示，BDNF干預(yù)組hUCBSC干預(yù)組大鼠視神經(jīng)的7 200 s應(yīng)力下降量大于模型組大鼠視神經(jīng)的7 200 s應(yīng)力下降量(P<0.05)，以hUCBSC干預(yù)組大鼠視神經(jīng)的7 200 s應(yīng)力下降量大于以BDNF干預(yù)組鼠視神經(jīng)的7 200 s應(yīng)力下降量(P<0.05)，各組大鼠視神經(jīng)試樣的應(yīng)力松弛曲線的函數(shù)表達(dá)關(guān)系均是以對數(shù)關(guān)系變化的。

3 討論

通過電生理檢測判斷視神經(jīng)損傷恢復(fù)效果是一種重要的檢測方法。各組大鼠視神經(jīng)電生理檢測結(jié)果表明，模型組大鼠視神經(jīng)峰值電壓小于視神經(jīng)損傷動物模型以BDNF干預(yù)治療組和以hUCBSC干預(yù)治療組(P<0.05)，模型組大鼠峰潛時值大于視神經(jīng)損傷動物模型以BDNF干預(yù)治療組和以hUCBSC干預(yù)治療組(P<0.05)，視神經(jīng)損傷動物模型以BDNF干預(yù)治療組Pl峰值電壓小于視神經(jīng)損傷動物模型以hUCBSC干預(yù)治療組(P<0.05)。

各組大鼠視神經(jīng)應(yīng)力松弛實驗結(jié)果顯示，視神經(jīng)損傷動物模型以BDNF干預(yù)組和以hUCBSC干預(yù)組大鼠視神經(jīng)的7200s應(yīng)力下降量大于視神經(jīng)損傷動物模型組(P<0.05)，視神經(jīng)損傷動物模型以BDNF干預(yù)組7200s應(yīng)力下降量小于以hUCBSC干預(yù)組 (P<0.05)，各組大鼠視神經(jīng)試樣的應(yīng)力松弛曲線均以對數(shù)函數(shù)關(guān)系變化，視神經(jīng)損傷后改變了視神經(jīng)的應(yīng)力松弛特性。

大鼠視神經(jīng)電生理、應(yīng)力松弛檢測結(jié)果證明，視神經(jīng)損傷模型大鼠以BDNF、hUCBSC干預(yù)治療后，對視神經(jīng)損傷模型大鼠電生理指標(biāo)、應(yīng)力松弛特性指標(biāo)具有恢復(fù)的作用，說明視神經(jīng)損傷模型大鼠通過以BDNF神經(jīng)營養(yǎng)因子、人臍血干細(xì)胞(hUCBSC)干預(yù)治療，具有一定的療效，以hUCBSC的干預(yù)治療神經(jīng)損傷模型大鼠的效果更好。

視神經(jīng)為粘彈性生物材料，粘彈性生物材料的粘彈性的表現(xiàn)形式主要為蠕變和應(yīng)力松弛，視神經(jīng)的應(yīng)力松弛特性是視神經(jīng)承受應(yīng)變適應(yīng)性的反應(yīng)。視神經(jīng)的應(yīng)力松弛特性是為了適應(yīng)其生理功能需要而存在的，視神經(jīng)正常范圍的應(yīng)力松弛力學(xué)特性有利于抵抗恒變形對視神經(jīng)的傷害，完整結(jié)構(gòu)的視神經(jīng)應(yīng)力松弛特性有利于視神經(jīng)的生理功能需。分析認(rèn)為，大鼠視神經(jīng)損傷后，纖維結(jié)構(gòu)紊亂、排列發(fā)生了改變，對應(yīng)力松弛特性產(chǎn)生了影響。視神經(jīng)損傷通過以hUCBS、BDNF干預(yù)治療后視神經(jīng)的應(yīng)力松弛特性得到了一定的恢復(fù)。

Chen等[10]對視神經(jīng)損傷動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，在動物玻璃體腔內(nèi)注入BDNF，1周后視網(wǎng)膜存活的RGCs比例增高，得出了視神經(jīng)損傷動物模型以BDNF干預(yù)治療有一定的效果，RGCs具有保護(hù)軸突作用的結(jié)論。大量的研究結(jié)果表明，外源性供給BDNF及GDNF可很好的改善節(jié)細(xì)胞的存活率,促進(jìn)節(jié)細(xì)胞軸突再生[11]。本實驗結(jié)果支持參考文獻(xiàn)[11]視神經(jīng)損傷模型動物通過BDNF干預(yù)治療可改善視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活率,促進(jìn)節(jié)細(xì)胞軸突再生的觀點，

臍血作為干細(xì)胞的重要來源，廣泛的應(yīng)用于修復(fù)神經(jīng)損傷的臨床及基礎(chǔ)研究中，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞對神經(jīng)損傷修復(fù)的機(jī)制尚未完全搞清楚，分析認(rèn)為，其作用機(jī)理系由于在局部微環(huán)境的刺激下，干細(xì)胞通過自分泌的形式產(chǎn)生各種細(xì)胞因子向受損組織分化并替代受損細(xì)胞，與周圍細(xì)胞建立聯(lián)系促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[12-14]。

以往以藥物干預(yù)治療視神經(jīng)損傷動物的效果以電生理測試、觀察組織形態(tài)等研究居多[1]。本實驗與以往研究的區(qū)別是，對比分析了對視神經(jīng)損傷模型大鼠、視神經(jīng)損傷模型大鼠以BNTF、以hUCBSC干預(yù)治療后視神經(jīng)的應(yīng)力松弛特性，以歸一化分析的方法的方法處理各組大鼠視神經(jīng)的應(yīng)力松弛實驗數(shù)據(jù)，得出了各組大鼠視神經(jīng)的歸一化應(yīng)力松弛函數(shù)方程，建立大鼠視神經(jīng)的歸一化應(yīng)力松弛函數(shù)方程，能定量的闡明大鼠視神經(jīng)的應(yīng)力松弛力學(xué)特性。本文的創(chuàng)新性是以視神經(jīng)的應(yīng)力松弛特性等研判視神經(jīng)損傷模型以BNTF、以hUCBSC干預(yù)視神經(jīng)損傷的效果。

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吉林省科技發(fā)展計劃資助項目(20110492)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0901-04

2016-12-24)