鹿茸多肽對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松預(yù)防作用的研究

龔 慶， 趙文海， 宋秋瑩，尹宏兵，冷向陽(yáng)

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨科，吉林 長(zhǎng)春130021)

*通訊作者

鹿茸多肽對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松預(yù)防作用的研究

龔 慶， 趙文海， 宋秋瑩，尹宏兵，冷向陽(yáng)*

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨科，吉林 長(zhǎng)春130021)

骨質(zhì)疏松癥是一類以骨量減少、骨組織微觀形態(tài)退化為特征的代謝性疾病，絕經(jīng)后婦女為骨質(zhì)疏松癥的高發(fā)人群。患骨質(zhì)疏松癥后，骨組織強(qiáng)度降低，增高了骨折發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也會(huì)引起骨質(zhì)疏松疼痛，以腰部疼痛尤為嚴(yán)重，極大地影響了患者的生活質(zhì)量、消耗了醫(yī)療資源[1]。骨質(zhì)疏松癥已成為全球性的公共健康問(wèn)題。鹿茸是脊索動(dòng)物門哺乳綱鹿科梅花鹿或者馬鹿雄鹿未骨化密生絨毛的幼角，鹿茸多肽是鹿茸中提取的主要活性成分，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽具有刺激成骨細(xì)胞增殖分化的作用[2,3]。本實(shí)驗(yàn)將探究低、中、高劑量鹿茸多肽對(duì)于去卵巢大鼠血清骨代謝指標(biāo)、股骨骨密度、股骨力學(xué)指標(biāo)、股骨微觀形態(tài)的影響作用，探究鹿茸多肽對(duì)于去卵巢骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

動(dòng)物與藥品:Wistar大鼠48只，雌性，清潔級(jí)，體重量 180±10 g (由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK-(吉)2012-0005)；鹿茸多肽樣品(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué))；阿侖膦酸鈉片，規(guī)格：6片/盒，10mg/粒(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司)。

試劑:鈣(Ca2+)測(cè)試盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20152824)；堿性磷酸酶(ALP)測(cè)試盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20153463)。酸性磷酸酶(ACP)測(cè)試盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20158235)；骨鈣素(OC)放射免疫分析藥盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20157235)。

儀器:PUS-2018G半自動(dòng)生化分析儀(普朗醫(yī)療科技公司)；BI-2000圖象分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司)；美國(guó) HOLOGIC discovery WA 骨密度測(cè)定儀；CSS-44100生物力學(xué)測(cè)試儀(長(zhǎng)春試驗(yàn)機(jī)研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 取雌性Wistar大鼠48只，應(yīng)用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒鋪單，其中40只摘除雙側(cè)卵巢，其余8只在相同位置做切口而不摘除卵巢作為假手術(shù)組。術(shù)后腹腔注射青霉素鈉10萬(wàn)單位/只，連續(xù)3天給予10萬(wàn)單位/只。術(shù)后15天，將摘除卵巢大鼠隨機(jī)分為模型組、阿侖膦酸鈉(陽(yáng)性藥)組、鹿茸多肽低、中、高劑量組，每組8只。

1.2.2 藥物劑量設(shè)計(jì) 陽(yáng)性對(duì)照藥阿侖膦酸鈉臨床用量10 mg/人/日，即0.14 mg/kg(人均體重按70 kg計(jì))，折算成大鼠的等效劑量為24 mg/kg，作為該試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照藥阿侖膦酸鈉的劑量行灌胃給藥。鹿茸中國(guó)藥典生藥推薦量為2 g/d，生藥中鹿茸提取率為0.9%，換算成大鼠的鹿茸多肽每日等效劑量為45 mg/kg。設(shè)鹿茸多肽低、中、高劑量分別為90 mg/kg,45 mg/kg，22.5 mg/kg。模型組、假手術(shù)組給予等容量的蒸餾水。以上各組進(jìn)行每日灌胃，連續(xù)灌胃3個(gè)月。

1.2.3 標(biāo)本采樣 末次給藥后8 h開(kāi)始禁食(自由飲水)，末次給藥后24 h，用6%水合氯醛麻醉(0.5 ml/100 g)后由腹主動(dòng)脈取血，3 000 轉(zhuǎn)/min離心5 min，取血清。處置后取左、右兩側(cè)股骨。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè) 血清生化指標(biāo)檢測(cè)：應(yīng)用PUS-2018G半自動(dòng)生化分析儀測(cè)血清中Ca2+、ACP、ALP、OC含量。股骨BMD測(cè)定：所有組別均進(jìn)行股骨骨密度測(cè)定。具體步驟為：取左側(cè)股骨，按美國(guó) HOLOGIC discovery WA 骨密度測(cè)定儀的說(shuō)明書(shū)的操作步驟，將股骨放在骨密度測(cè)定儀的投影區(qū)，進(jìn)行掃描，獲取骨密度數(shù)據(jù)。股骨生物力學(xué)檢測(cè)：取左側(cè)股骨，使用CSS-44100生物力學(xué)測(cè)試儀在跨距20 mm、速度5 mm/s的條件下測(cè)量其最大彎曲力、斷裂撓度的生物力學(xué)指標(biāo)。骨結(jié)構(gòu)光鏡觀察：取右側(cè)股骨用10%甲醛固定，脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，采用BI-2000圖象分析系統(tǒng)拍取骨皮質(zhì)，骨小梁靜態(tài)圖像，并測(cè)量圖像中骨皮質(zhì)平均厚度和骨小梁面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 血清生化指標(biāo)結(jié)果

如表1所示，與模型組相比，鹿茸多肽各劑量組均對(duì)血清鈣離子水平有升高作用，且高劑量鹿茸多肽升高血清Ca2+[(2.572±0.183)mmol/L]的效果優(yōu)于中[(2.535±0.220)mmol/L]、低劑量組[(2.524±0.289)mmol/L]，同時(shí)也優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組[(2.497±0.251)mmol/L]；低、中、高劑量鹿茸多肽均可以降低血清ALP、ACP和OC，陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 股骨BMD、骨力學(xué)測(cè)量結(jié)果

如表2所示，鹿茸多肽高[(0.221±0.012)g/cm3]、中[0.228±0.015)g/cm3]、低[(0.221±0.012)g/cm3]劑量組相比模型組[(0.212±0.018)g/cm3]均可以明顯增高股骨BMD值(P<0.05)，而鹿茸多肽各劑量組間比較則未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)。在力學(xué)測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，鹿茸多肽各劑量組均可以增加股骨力學(xué)性能,而高劑量鹿茸多肽對(duì)于增加最大彎曲力[110.11±9.341)N]和斷裂撓度[3.511±0.521)mm]作用最強(qiáng)，且鹿茸多肽對(duì)股骨斷裂撓度增加量甚至高于假手術(shù)組和陽(yáng)性對(duì)照組。

表1 鹿茸多肽對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠(去卵巢模型)血清生化指標(biāo)的影響±s，n=8)

注：與假手術(shù)組比較：△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001；與模型組比較：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

表2 鹿茸多肽對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠(去卵巢模型)骨密度、骨力學(xué)、骨皮質(zhì)厚度、骨小梁面積的影響±s，n=8)

注：與假手術(shù)組比較：△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001；與模型組比較：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

2.3 股骨骨微觀形態(tài)觀察測(cè)量

股骨微觀結(jié)構(gòu)如圖1和圖2所示，通過(guò)對(duì)微觀結(jié)構(gòu)下股骨骨皮質(zhì)厚度和骨小梁面積進(jìn)行觀察測(cè)量發(fā)現(xiàn)，與模型組相比， 陽(yáng)性對(duì)照組增加股骨皮質(zhì)厚度[(249.7±24.55對(duì)183.3±37.70) μm，P<0.01)]和骨小梁面積[(65624.3±15042.9對(duì)28424.4±9034.8) μm3，P<0.01)]具有顯著作用，鹿茸多肽各劑量組效果雖然不如陽(yáng)性對(duì)照組，但仍可以顯著改善股骨骨皮質(zhì)厚度增厚和骨小梁面積(P<0.05)。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一類代謝性骨病，其病理特征為骨量減少、骨皮質(zhì)變薄及骨小梁數(shù)量減少。患骨質(zhì)疏松癥后，骨組織力學(xué)強(qiáng)度嚴(yán)重下降，極大地增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，骨質(zhì)疏松癥也會(huì)導(dǎo)致以腰背疼痛為主骨質(zhì)疏松疼痛，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。絕經(jīng)后女性由于雌激素缺乏，是骨質(zhì)疏松癥的高發(fā)人群。

鹿茸為鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿雄鹿未骨化密生絨毛的幼角，《本草綱目》中記載鹿茸具有“善于補(bǔ)腎壯陽(yáng)，生精益血，補(bǔ)髓健骨”的功效。鹿茸多肽為鹿茸中主要的活性物質(zhì)，近年來(lái)關(guān)于鹿茸多肽的多種藥理活性已經(jīng)有了證實(shí)，如促進(jìn)傷口皮膚愈合、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)神經(jīng)損傷再生、保護(hù)心肌細(xì)胞、修復(fù)軟骨損傷等[4-7]。呂秀華等在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了鹿茸多肽可以促進(jìn)M3T3-E1細(xì)胞增殖和成骨方向表達(dá)[8]；趙長(zhǎng)偉等通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者服用鹿茸多肽后骨質(zhì)疏松臨床癥狀發(fā)生明顯好轉(zhuǎn)[9]。本研究在構(gòu)建大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型后，利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析鹿茸多肽對(duì)于骨質(zhì)疏松治療情況，并將治療組分為3種劑量，評(píng)價(jià)鹿茸多肽對(duì)于骨質(zhì)疏松癥的最佳治療劑量。

注：放大倍數(shù)：400×；A為模型組；B為陽(yáng)性對(duì)照組；C為假手術(shù)組；D為鹿茸多肽低劑量組；E為鹿茸多肽中劑量組；F為鹿茸多肽高劑量組。

注：放大倍數(shù)：400×；A為模型組；B為陽(yáng)性對(duì)照組；C為假手術(shù)組；D為鹿茸多肽低劑量組；E為鹿茸多肽中劑量組；F為鹿茸多肽高劑量組。

血清Ca2+、ALP、ACP和OC是機(jī)體骨轉(zhuǎn)換代謝的典型標(biāo)志物，通過(guò)其數(shù)值的變化可以判斷機(jī)體骨代謝水平[10]。研究發(fā)現(xiàn)，給予鹿茸多肽后，血清鈣水平明顯升高，提示鹿茸多肽利于機(jī)體對(duì)鈣離子吸收。而血清堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和骨鈣素在給藥后均有下降的作用，說(shuō)明鹿茸多肽有著抑制破骨細(xì)胞活性、減少骨吸收破壞的作用。

股骨BMD、骨力學(xué)強(qiáng)度是評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度的最重要指標(biāo)，BMD、骨力學(xué)強(qiáng)度的改善使得骨質(zhì)疏松患者骨折風(fēng)險(xiǎn)大大減小，明確提升了患者生活生存質(zhì)量。鹿茸多肽顯著促進(jìn)骨組織生長(zhǎng)，利于骨沉積作用，增加了骨密度和骨力學(xué)性能。觀察骨微觀形態(tài)可以最直觀的評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松情況，骨質(zhì)疏松的重要病理特征為骨量的減少，通過(guò)顯微鏡下觀察測(cè)量股骨皮質(zhì)厚度和骨小梁面積而判斷骨量情況。鹿茸多肽可以增加骨皮質(zhì)厚度和骨小梁面積，說(shuō)明其有著良好的改善骨質(zhì)，預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鹿茸多肽對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥模型有顯著的預(yù)防作用， 研究中所檢測(cè)的各項(xiàng)指標(biāo)與臨床骨質(zhì)疏松患者情況平行，可考慮將實(shí)驗(yàn)成果進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化。在我們的研究中尚未涉及鹿茸多肽對(duì)于骨質(zhì)疏松癥預(yù)防作用的機(jī)制研究，后續(xù)研究中我們將進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。

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1007-4287(2017)05-0890-04

2016-08-27)